Dazu wird zunächst DNA eines Plasmids, das als Vektor eingesetzt wird, und DNA von einem fremdem Organismus mit einem Restriktionsenzym (z.B. Eco RI in Abb. 2.38) gespalten. Das Vektormolekül wird so gewählt, daß es nur eine Schnittstelle für Eco RI aufweist, so daß das ringförmige Molekül linearisiert werden kann. Falls die Spender-DNA von einem höheren Organismus stammt, ist sie sehr komplex, so daß tausende verschiedener RI-Fragmente (A, B, usw.) entstehen. Diese Fragmente werden mit den liearen Vektormolekülen unter Hybridisierungsbedingungen zusammengebracht, so daß die komplementären Enden Basenpaarungen eingehen. Nach anschließender Behandlung mit DNA-Ligase können sich Hybridplasmide bilden, in denen ein Fragment (A oder B oder...) der Spender-DNA in ein Vektormolekül eingebaut hat. Es treten auch andere Rekombinationen zwischen verschiedenen Spenderfragmenten oder zwischen zwei Vektormolekülen auf, doch können diese anschließend eliminiert werden.