Die enzymatischen Prozesse an der Replikationsgabel sind bei E. coli am besten untersucht. Die Replikation der beiden Tochterstränge erfolgt in entgegengesetzter Richtung. Die Neusynthese des führenden Stranges erfolgt in der gleichen Richtung wie das Aufwinden (Entspiralisieren) der DNA, während die Synthese des entgegengesetzten Strangs in der Gegenrichtung abläuft und zwar in Bruchstücken, die anschließend von einer Ligase verknüpft werden. Das wichtigste Enzym bei der Replikation ist die DNA-Polymerase III. Diese benötigt außer dem DNA-Einzelstrang (als Matrize) zusätzlich einen Primer (kurzer Einzelstrang einer komplementären RNA-Sequenz) als Startpunkt für die Replikation. Der Primer wird von einer speziellen RNA-Polymerase (Primase) synthetisiert. Die Funktion der DNA-Polymerase I besteht darin, den RNA-Primer anschließend zu entfernen und durch DNA zu ersetzen. Außer diesen sind noch eine Helicase (zum Aufwinden der DNA-Helix) beteiligt sowie mehrere DNA-bindende Proteine, die die verschiedenen Zwischenstufen beim Synthesevorgang stabilisieren.