Zusammenfassung Wehner-Gehring: "Zoologie", 22. Auflage (Thieme, Stuttgart)

B. Organismus: genetisches Programm und seine Realisation

2. Vererbung

2.1 Die Natur der Erbsubstanz

Mendel (1822-1884) entdeckte, daß die Vererbungsvorgänge auf diskreten Erbfaktoren (Genen) beruhen. Die Bedeutung der Mendel'schen Gesetze (1866) blieb zunächst unerkannt, bis sie zur Jahrhundertwende von De Vries , Correns und Tschermak wiederentdeckt wurden. Boveri und Sutton erkannten 1902 schließlich, daß sich die Mendelschen Gesetze aus dem Verhalten der Chromosomen in Meiose und Befruchtung widerspruchsfrei ergeben, und begründeten die Chromosomentheorie der Vererbung. Die Hypothese, daß die Gene auf den Chromosomen lokalisiert sind, wurde später von MORGAN et al. an Drosophila bestätigt. Anhand von Fehlverteilungen konnte BRIDGES bestimmte Gene eindeutig bestimmten Chromosomen zuordnen. STURTEVANI erbrachte 1913 den Nachweis, daß die Gene linear auf den Chromosomen angeordnet sind.
Die Aufklärung der chemischen Natur der Gene erfolgte zunächst unabhängig von den genetischen Untersuchungen. Miescher entdeckte 1869 in den Zellkernen von Lymphocyten eine neue Klasse organischer Stoffe, die Nucleinsäuren, die außer Kohlenstoff, Wesserstoff, Sauerstoff und Stickstoff einen hohen Anteil an Phosphor enthalten. 1944 konnten Avery, Mac Leod und McCarthy nachweisen, daß es sich bei den Nucleinsäuren um die materiellen Träger der Erbinformationen handelte. Der Nachweis von Avery beruht auf Beobachtungen von Griffith, der 1928 gezeigt hatte, daß die erblichen Eigenschaften von abgetöteten auf lebende Bakterien übertragen werden können. Griffith. Es gelang nachzuweisen, daß avirulente Bakterien in virulente umgewandelt werden können, wenn man sie gleichzeitig mit virulenten Bakterien, die vorher mit Hitzebehandlung abgetöte wurden. Diese Umwandlung nennt man Transformation. In einer Reihe sorgfältig geplanter Experimente gelang es Avery et al., die biologisch aktive Fraktion aus den abgetöteten Bakterien zu isolieren und eindeutig zu zeigen, daß es sich bei dem "transformierenden Prinzip" um DNA handelt.
Ein weiterer Hinweis dafür ergab sich aus den Versuchen von Hershey und Chase (1952) an Bakteriophagen; das sind Viren, die Bakterien befallen. Sie bestehen aus Nucleinsäuren, die von einer Proteinhülle umgeben sind. Sie setzen sich an der Oberfläche von Bakterien fest und injezieren ihre Nucleinsäuren ins Bakterieninnere.
Watson und Crick postulierten schließlich die Struktur der DNA: Sie besteht aus zwei komplementären Strängen, die zu einer Doppelhelix aufgewunden sind. Kettenbausteine sind die 4 Nucleotide, die aus einer Purin- oder Pyrimidinbase, Desoxyribose und einem Phosphatrest bestehen. Sie sind als Zucker-Phosphatester zu langen Polynucleotidketten zusammengesetzt und weisen eine 5'-3'-Polarität entsprechend der Phosphodiesterbindung auf (vgl. Abb. 2.1).

Abb. 2.1: Der molekulare Aufbau der RNA (Ribonucleinsäure) und DNA (Desoxyribonucleinsäure). Die Pyrimidinbasen Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U) sowie die Purinbasen Guanin (G) und Adenin (A) sind farbig hervorgehoben. Die Basen bilden zusammen mit den Zuckermolekülen Ribose bzw. Desoxyribose die entsprechenden Ribo- bzw. Desoxyribonucleoside. Die Nucleosidphosphate werden als Nucleotide bezeichnet. In der RNA sind die Basen A, G, C und U über das Zucker-Phosphat-Rückgrat zu einem Polynucleotid verknüpft. Die 3'-Hydroxylgruppe des ersten Ribonucleotids A ist über eine Phosphodiesterbindung mit der 5'-Hydroxylgruppe des nächsten Nucleotides C verknüpft. Damit erhält die Polynucleotidkette ihre 5'-3'-Polarität (Pfeil). Die doppelsträngige DNA enthält Desoxyribose und die Basen A, G, C und T. Die beiden gegenläufigen Stränge werden durch Wasserstoffbrücken (gestrichelt) zwischen A und T bzw. G und C zusammengehalten. Die schwarzen Punkte symbolisieren Phosphatgruppen.

Die beiden Stränge haben entgegengesetzte Polarität und werden durch Wasserstoffbrücken zwischen den basen zusammengehalten. Dabei paaren sich Adenin und Thymin (A=T) über zwei, Guanin und Cytosin (GºC) über drei Wasserstoffbrücken. Damit ergibt sich ein Stoffmengenverhältnis A/T bzw. G/C von jeweils 1.
Die Struktur der DNA erinnert an eine gewundene Strickleiter. Die Basenpaare liegen als plane Ringe im Inneren der Doppelhelix, das "Zucker-Phosphat-Rückgrat" liegt außen (vgl. Abb. 2.2).

Abb. 2.2: Modell der DNA-Doppelhelix (B-Form). Die Basenpaare (bp) sind farbig dargestellt; im Zucker-Phosphat-Rückgrat (R) sind die Phosphoratome schwarz, die Kohlenstoffatome grau und die Wasserstoffatome weiß gezeichnet. Die Doppelhelix weist eine große Rinne (gR) und eine kleine Rinne (kR) auf. Die Pfeile geben die 5'-3'-Polarität an.

Basierend auf diesem Modell ergaben sich für Watson und Crick folgende fundamentale Aussagen:

1. Die genaue Abfolge (Sequenz) der Basen ist der Code, der die genetische Informatin enthält.
2. Aus der Komplementarität der Stränge ergibt sich eine Möglichkeit, die Erbinformation exakt zu duplizieren (Replikation), indem sich die beiden Stränge trennen und als Matrize für je einen neuen komplementären Strang dienen. Der neue Strang wird dann nach den Regeln der Basenpaarung aus den entsprechenden komplementären Nucleotiden zusammengesetzt.

Beide dieser Hypothesen erwiesen sich später als richtig und haben einerseits zur Entschlüsselung des genetischen Codes, andererseits zur Aufklärung der Mechanismen der Replikation geführt.
Viele Prokaryoten, Zellorganellen und Viren besitzen ringförmige DNA. Bei bestimmten Viren ist die DNA auch einsträngig, doch durchlaufen solche Viren in ihrer Reproduktionsphase ebenfalls ein Doppelstrangstadium. Andere Viren besitzen RNA in ein- oder doppelsträngiger Form als Erbsubstanz.

2.2 DNA-Replikation

Im Verlauf der Zellteilung muß die genetische Information exakt repliziert und gleichmäßig auf die beiden Tochterzellen verteilt werden. Nach dem Watson-Crick-Modell müssen sich die beiden komplementären DNA-Stränge voneinander trennen und können je als Matrize für einen neune Strang dienen (vgl. Abb. 2.3A). Diese Hypothese wird durch das Experiment von Meselson und Stahl bestätigt (vgl. Abb. 2.3B).

Abb. 2.3: DNA-Replikation. A: Schema der DNA-Replikation basierend auf der komplementären Basenpaarung nach Watson und Crick. Die beiden Stränge der DNA trennen sich und dienen je als Matritze für einen neuen DNA-Strang (farbig). B: Nachweis der semikonservativen DNA-Replikation durch Dichtemarkierung. 0-3 Generationen.

Die DNA-Synthese erfolgt enzymatisch durch DNA-Polymerasen, indem die vier Nucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) zu einer Polynucleotidkette polymerisiert werden. Die Polymerisation erfolgt stets in 5'-3'-Richtung; dazu müssen sich die beiden DNA-Stränge voneinander trennen und entspiralisieren.
Die Initiation der DNA-Replikation beginnt stets an einem definierten Ort, dem origin of replication (= ori). Dieser besteht aus einer bestimmten Basensequenz; durch seine Entfernung ist eine selbständige Replikation der DNA nicht mehr möglich. Die DNA-Sequenz am ori und die benötigten Proteinfaktoren unterscheiden sich bei verschiedenen Organismen. Eine Funktionseinheit, die selbständig replizieren kann, nennt man Replicon. Die Chromosomen der Prokaryoten bestehen i.d.R. aus nur einem Replicon.
Ein Replicon kann vom ori aus in nur einer oder beiden Richtungen gleichzeitig repliziert werden. Die verschiedenen Replikationsformen bei kreisförmigen DNA-Molekülen zeigt Abb. 2.4.

Abb. 2.4: Verschiedene Formen der DNA-Replikation. Ausgehend von einem Ursprung (ori) kann die Replikation A in beiden Richtungen (Q-Form) oder B nur in einer Richtung (D-Schleife) oder C als rollender Kreis erfolgen, wobei mehrere aneinandergekettete Moleküle (Concatemere Cc) entstehen. D Replikation linearer DNA. Die Richtung der Replikation ist mit Pfeilen angegeben.

Bei höheren Organismen beginnt die Replikation der linearen DNA an zahlreichen Startpunkten und verläuft meist bidirektional. Definierte ori sind bisher nicht identifiziert worden. An den Initiationsstellen trennen sich die beiden DNA-Stränge und es entstehen "Blasen", die schließlich miteinander verschmelzen (vgl. Abb. 2.4D). Die Initiation der nächsten Replikationsrunde erfolgt erst, wenn das ganze Chromosom repliziert ist.

Schwesterstrangaustausch. Dabei brechen zwei Schwesterstränge an entsprechender Stelle und tauschen Segmente aus. Erfolgt der Schwesterstrangtausch in der zweiten Mitose, manifestiert er sich in nur einem Chromosomenpaar (einfacher Austausch). Ein Schwesterstrangaustausch in der ersten Mitose resultiert in einem doppelten Austausch und manifestiert sich in beiden Chromosomenpaaren. Dieses Verteilungsmuster läßt sich nur durch die Hypothese einer uninemen Chromosomentruktur erklären. Das eukaryotische Chromosom enthält also nur eine einzelne DNA-Doppelhelix, die – ausgehend von zahlreichen Initiationsstellen – seminkonservativ repliziert wird.
Replikation bei E. coli.
Replikation bei höheren Organismen: Hier sind 4 Polymerasen bekannt. Die DNA-Polymerasen a und d sind im Zellkern lokalisiert und an der Replikation des rückläufigen bzw. führenden Stranges der chromosomalen DNA beteiligt. Die DNA-Polymerase b scheint bei der Reparation defekter DNA und bei Rekombinationsvorgängen zwischen DNA-Molekülen eine Rolle zu spielen. Die DNA-Polymerase g ist hauptsächlich in den Mitochondrien lokalisiert und für die Replikation der ringförmigen mitochondrialen DNA verantwortlich.

2.3 Primäre Genwirkung und der genetische Code

Beadle, Ephrussi und Tatum formulierten die "One gene - one enzyme"-Hypothese, die besagt, daß ein Gen ein bestimtes Enzym spezifiziert. Da sowohl DNA als auch Proteine lineare Kettenmoleküle sind, liegt der Schluß nahe, daß die Reihenfolge der Basenbausteine der DNA den Aufbau der Proteine bestimmt. Da DNA aus nur vier Nucleotiden, Proteine aber aus 20 Aminosäuren aufgebaut sind, schloß man auf einen genetischen Code, mit dem die beiden "Sprachen" ineinander übersetzt werden; der Nachweis der Gültigkeit dieses Codes gelang Anfang der 60er Jahre experimentell.
Die Information wird aber nicht direkt von der DNA auf das Protein übertragen, denn bei Eukaryoten ist die DNA im Zellkern lokalisiert, die Proteinsynthese findet aber im Cytoplasma statt. Jacob und Monod entwickelten das Konzept der Messengers. Aus der Kinetik der Enzyminduktion schlossen sie, daß eine kurzlebige Zwischenstufe zwischen DNA und Protein exisitieren muß und vermuteten, daß es sich um RNA handeln muß, was durch BRENNER, JACOB und MESELSON später experimentell bestätigt werden konnte. Die Umschreibung der DNA in RNA ist die Transkription. RNA besteht im Gegesatz zu DNA aus Ribonucleotiden, die Ribose statt Desoxiribose enthalten, außerdem wird Thymin durch Uracil ersetzt. RNA, die als Basensequenz die Information für ein bestimmtes Protein enthält, nennt man messenger-RNA (mRNA). Die Information in der mRNA wird anschließend in ein Protein übersetzt (Translation).

Biochemische Untersuchungen bestätigten die Annahme eines Triplett-Codes: Drei Basenpaare codieren für eine Aminosäure (vgl. Tab. 2.1).

Der genetische Code ist prinzipiell universell. Das ist ein Hinweis auf die stammesgeschichtliche Verwandtschaft aller Organismen unerseres Planeten. Ausnhmen sind bisher nur bei Protozoen und Mitochondrien verschiedener Organismen gefunden worden, bei denen einzelne Codons vom universalen Codon abweichen. Der Code enthält zahlreiche Synonyme für einzelne Aminosäuren ("Degeneration des Codes"), die sich meist in der 3. Stelle des Tripletts unterscheiden. Außerdem existiert ein Codon für den Start und 3 für den Stop der Translation.

2.4 Transkription und Prozessierung der DNA

Bei der Transkription wird die genetische Information von der DNA zunächst in RNA umgeschrieben. Dabei wird die Information im allgemeinen nur abschnittsweise und ausschließlich von einem der beiden komplementären DNA-Stränge abgelesen (s.a. Abb. 2.41). Wenn der eine Strang eine bestimmte genetische Information enthält, ist die Möglichkeit der Informationsspeicherung im anderen Strang stark eingeschränkt, da die beiden ja komplementär sein müssen. Trotzdem werden z.B. bei Viren mit kleinem Genom in Ausnahmefällen beide DNA-Stränge transkribiert.
Unter bestimmten Bedingungen kann auch eine RNA-Kette mit dem komplementären DNA-Strang eine stabile Doppelhelix bilden, es entsteht ein sog. Hybridmolekül. Dieser Umstand hat zur Entwicklung der Methode der Nucleinsäurehybridisierung geführt (vgl. Abb. 2.8), wobei nur teilweise komplemetäre RNA- oder DNA-Moleküle an die Zielstränge binden. Da sich die Hybridmoleküle isolieren und von einsträngigen Molekülen trennen lassen, kann man mit dieser Methode feststellen, ob zwei Nucleinsäuren komplementäre Basensequenzen enthalten.

Abb. 2.8: Hybridisierung von Nucleinsäuren. Das Schema zeigt RNA-DNA-Hybridisierung auf Filtern. Die doppelsträngige DNA (dDNA) wird denaturiert und die entstehenden Einzelstränge (sDNA) werden an ein Nitrocellulosefilter adsorbiert, das in eine Lösung radioaktiv markierter RNA (farbig) eingetaucht wird. Einsträngige Nucleinsäurenmoleküle können unter bestimmten Bedingungen über Wasserstoffbrücken an komplementäre Stränge binden, wobei Hybridmoleküle entstehen. Die Partnermoleküle brauchen nicht auf ihrer ganzen Länge komplementär zu sein. Durch die radioaktive Markierung der RNA kann die Menge der gebildeten Hybridmoleküle auf dem Filter bestimmt werden. Anstelle von RNA kann auch einsträngige DNA verwendet werden.

Bei Eukaryoten sind bisher 4 Hauptklassen von RNA gefunden worden: Ribosomale RNA (rRNA) bildet einen stabilen Strukturbestandteil der Ribosomen aus vier unterschiedlichen Bestandteilen (18s-RNA – Bestandteil der kleinen Ribosomenuntereinheit; 28s- und 5,8s-RNA – Bestandteil der großen Ribosomenuntereinheit); transfer-RNA (tRNA) dient als Adaptor bei der Proteinsynthese; small-nuclear-RNA (snRNA) sind hauptsächlich am Verspleißen der RNA-Moleküle im Kern beteiligt; messenger-RNA (mRNA) codiert für Proteine und wird von den Ribosomen in Protein übersetzt.
Die RNA wird von RNA-Polymerasen synthetisiert. Als Matrize dient i.d.R. doppelsträngige DNA; als Bausteine werden Nucleosidtriphosphate verwendet (ATP, GTP, CTP, TTP) verwendet.
Die Promotor-, Initiantions- und Terminationssequenzen sind im Gegensatz zu den Codons von Gen zu Gen und von Organismus zu Organismus verschieden. Sie repräsentieren sog. Consesnsussequenzen und bilden Erkennungssignale für die RNA-Polymerase oder bestimmte Proteine, mit denen sie dann wechselwirken. Bei Prokaryoten sind Gene mit verwandten Funktionen meist zu einer funktionellen Einheit (Operon, Abb. 2.44) zusammengefaßt, die gemeinsam in eine mRNA transkribiert werden; dabei entsteht eine polycistronische mRNA. Bei Eukaryoten sind bisher nur monocystronische mRNA gefunden worden.

Abb. 2.41: Genstruktur. Struktur des Hitzeschockgens (hsp22). HSE = Hitzeschockelement TATAAA = TATA-Box AAUAAA = Polyadenylierungssignal 7 mG = Kappe der mRNA +1 = Start der Transkription AUG = Initiator-Methionin-Codon UAG = Stopcodon D = Polyadenylierungsstelle

Bei Eukaryoten findet man drei unterschiedliche RNA-Polymerasen. Die RNA-Polymerase I transkribiert die ribosomalen 18s-, 25s- und 5,8s-Gene und ist hauptsächlich in den Nucleoli lokalisiert. Die RNA-Polymerase II synthetisiert die verschiedenen mRNA- sowie die meisten snRNA-Moleküle im Zellkern und ist v.a. in den Puffs angereichert. Sie wird spezifisch durch a-Amanitin (Gift des Knollenblätterpilz) gehemmt. Die RNA-Polymerase III transkribiert die ribosomale 5s-RNA, die tRNA sowie einige virale Gene. Sie kann nur durch sehr hohe Konzentrationen von a-Aminitin gehemmt werden.
Häufig entspricht das primäre Transkript nicht der funktionstüchtigen RNA, sondern wird sekundär modifiziert (RNA-Prozessierung):

• Spaltung des pimären Transkripts (z.B. bei der rRNA, bei der aus einem gemeinsamen Vorläufermolekül die funktionellen Spaltprodukte gebildet werden)
• Verspleißen: bei eukaryotischen mRNA-Molekülen können nichtcodierende Sequenzen herausgespalten und die freien Enden der codierenden Segemente verknüpft werden
• Chemische Modifikation der Basen. Besonders bei rRNA werden bestimmte Basen durch spezifische Enzyme methyliert. Bei vielen tRNA-Molekülen findet man "ungewöhnliche" Basen wie Pseudouridin, Dihydrouridin oder Ribothymidin, die durch Modifikation normaler Basen (Uracil) entstehen
• Addition von Basen kommt bei den meisten tRNA-Molekülen vor, indem am 3'-Ende die Sequenz CCA durch ein spezielles Enzym angefügt wird
• Polyadenylierung. Bei Eukaryoten werden am 3'-Ende der meisten mRNA-Moleküle durch eine spezielle Polymerase etwa 150-200 Adeninreste angehängt (PolyA-RNA)
• Capping. Die eukaryotischen mRNA-Moleküle weisen einmodifiziertes 5'-Ende auf, das durch Addition eines 7-Methylguanins entsteht. Dieses ist über eine ungewöhnliche 5'-5'-Bindung mit der ersten Base des Transkripts verbunden (mRNA-Kappe). Die snRNA weist eine besondere Trimethylguaninkappe auf

Erst die entsprechend modifizierten Transkripte können ihre Funktion als Messenger in der Proteinsynthese, als strukturelle Komponenten des Ribosoms oder als Adaptoren versehen.

2.5 Translation (Proteinsynthese)

Der Vorgang der Proteinsynthese wird als Translation bezeichnet, weil hierbei der genetische Code (aus 4 verschiedenen Nucleinsäuren aufgebaut) in ein Protein übersetzt wird (aus 20 verschiedenen Aminosäuren). Zur Erklärung des Übersetzungsvorgangs hat CRICK die sog. Adaptorhypothese vorgeschlagen. Diese hat sich als weitgehend zutreffend erwiesen: Das Adaptormolekül ist die tRNA, das hochspezifische Enzym die Aminoacyl-tRNA-Synthetase. So werden Aminosäuren an das Adaptormolekül gebunden, die Adaptormoleküle übertragen ihre Aminosäuren entsprechend der Codons in der mRNA in den Aminosäurestrang des entstehenden Proteins.
Transfer-RNA-Moleküle sind einsträngig und bestehen aus 70-90 Ribonucleotiden. Sie enthalten viele ungewöhnliche Basen wie z.B. Pseudouridin und Ribothymidin (aus Uracil durch Modifikation entstanden). DIe Nucleotidsequenz vieler tRNA-Moleküle ist heute bekannt, z.T. einschließlich ihrer dreidimensionalen Struktur. Durch Basenpaarung (A=U und GºC) ergibt sich eine dreidimensionale, L-förmige Struktur (vgl. Abb. 2.10B), die zweidimensional an ein Kleeblatt erinnert (Abb. 2.10A).

Abb. 2.10: Struktur einer transfer-RNA (Phenylalanin-tRNA von Hefe). A: Basensequenz und zweidimensionale Darstellung (Kleeblattstruktur). Die tRNA wird am CCA-Terminus des Akzeptorstamms mit einer Aminosäure (Phenylalanin) beladen. Das Anticodon GAA bindet an das entsprechende Codon (UUC oder UUU) mit gegenläufiger Polarität. Die D-Schleife enthält Dihydro-Uracil. Die T-Schleife ist durch die Sequenz TYC charakterisiert. Die mit * gekennzeichneten Basen sind methyliert. B: Dreidimensionale Struktur, bestimmt durch Röntgenstrukturanalyse (schematisch). A = Adenin C = Cytosin D = Dihydro-Uracil G = Guanin T = Ribothymin U = Uracil Y = Wybutosin Y = Pseudo-Uracil

An einem Ende der L-Struktur liegt das Anticodon (aus drei Nucleotiden), das komplementär zum entsprechenden Codon ist und eine umgekehrte 5'3'-Polarität aufweisen. Codon und Anticodon können spezifisch miteinander paaren (Wasserstoffbrückenbindungen). Am anderen Ende des L-förmigen Moleküls liegt das 3'-Ende mit der Sequenz CCA, der Bindungsstelle für die Aminosäure. Diese drei Nucleotide werden nicht durch das entsprechende tRNA-Gen codiert, sondern in den meisten Fällen sekundär durch ein bestimmtes Enzym addiert. Das Beladen der tRNA mit der entsprechenden Aminosäure erfolgt durch spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Die Energie für die Bildung der Esterbindung wird durch die Hydrolyse von ATP zu AMP und anorganisches Phosphat geliefert (vgl. Abb. 4.1). Für jede der 20 Aminosäuren gibt es eine spezielle Aminoacyl-tRNA-Synthetase und ein oder mehrere tRNA-Moleküle (Isoakzeptoren), die von separaten tRNA-Genen codiert werden. Sie können das gleiche oder verschiedene Anticodon enthalten.
Ein beladenes tRNA-Molekül kann in manchen Fällen mehr als ein Codon erkennen; z.B. kann Hefe-Phenylalanin-tRNA an die beiden Codons UUU oder UUC binden. Crick erklärt das mit seiner Wobbel-Hypothese. Danach ist die Basenpaarung des dritten Nucleotids eines Codons weniger spezifisch als die der beiden ersten Basen.
Der Translationsvorgang findet an den Ribosomen statt (Abb. 1.4, 2.11).

Abb. 2.11: Biosynthese von Proteinen (Translation).  Der Translationsprozeß beginnt mit der Bildung eines Initiationskomplexes, bestehend aus mRNA, kleiner Ribosomeneinheit (kR), Initiator-tRNA (Kleeblatt Met) und Initiationsfaktoren (nicht dargestellt). Anschließend wird die große Ribosomeneinheit (gR) gebunden. Die Initiator-tRNA besetzt die Peptidil-tRNA-Bindungsstelle (P) und binden mit dem Anticodon über Wasserstoffbrücken an das Codon (AUG) der mRNA. ‚ Die freie Aminoacyl-tRNA-Bindungsstelle (A) wird von der durch das nächste Codon spezifizierten Aminoacyl-tRNA (Phe) besetzt. Dieser Erkennungsvorgang beruht auf der Wechselwirkung zwischen Codon und Anticodon und wird durch sogenannte Elongationsfaktoren beschleunigt. ƒ Bildung der Peptidbindung zwischen Met und Phe. „ Dissoziation der entladenen tRNA und Translokation der Peptidyl-tRNA in die P-Stelle. Die A-Stelle wird damit für die nächste beladene tRNA (Arg) frei. A, C, G, U Basen.

Dabei kann ein Messenger gleichzeitig von mehreren Ribosomen übersetzt werden. Bei Prokaryoten sind Transkription (RNA-Synthese) und Translation (Proteinsynthese) eng miteinander gekoppelt, da die Ribosomen an das RNA-Transkript bereits vor seiner Vollendung binden und mit der Proteinsynthese beginnen. Bei den Eukaryoten (mit Zellkern!) sind die beiden Prozeese getrennt. Mitochondrien und Chloroplasten haben ihre eigenen Proteinsynthesemaschinerien, deren Ribosomen bzeüglich ihrer Struktur und Funktion denjenigen der Prokaryoten ähnlicher sind als denen der Eukaryoten.
Die Richtung der Translation wurde durch Pulsmarkierung (Pulse-chase-Experiment) von Aminosäuren bestimmt. Nach einem kurzen Puls wird zunächst nur das Carboxylende der fertigen Polypeptidkette radioaktiv markiert. Mit der Zeit schreitet die Markierung dann in Richtung Aminoende fort. Daraus kann man schließen, daß der Einbau der Aminosäuren am Carboxylende zum Schluß erfolgt, kurz bevor die Polypeptidkette vom Ribosom entlassen wird. Die Translation beginnt also am Aminoende und endet am Carboxylende.
Auch bei der Translation sind drei Phasen unterscheidbar: Initiation, Elongation und Termination.

• Initiation: als Startsignal dient das Initiationscodon AUG, das für die Aminosäure Methionin codiert. Für die Initiation wird eine spezielle Initiator-RNA^Met verwendet, die sich im Ribosom an die P-Bindungsstelle und nicht wie die übrigen tRNA-Moleküle an die A-Stelle bindet (Abb. 2.11). Zu Beginn wird ein Initiationskomplex gebildet, der aus mRNA, einer kleinen Ribosomenuntereinheit und der beladenen Initiator-RNA besteht. Die Bildung dieses Komplexes erfordert mindestens drei zusätzliche Initiationsfaktoren (Proteine) und GTP. Bei der anschließenden Bindung an die große Ribosomenuntereinheit wird GTP zu GDP hydrolysiert. Die Initiator-tRNA besetzt die P-Bindungsstelle, wobei Codon und Anticodon gepaart sind. Damit ist das richtige Ableseraster gegeben und die Translation kann beginnen.
• Elongation: sie verläuft im wesentlichen in drei Schritten:

  • Bindung der entsprechenden Aminoacyl-tRNA (Codon-Erkennung)
  • Bildung der Peptidbindung
  • Translokation
• Termination erfolgt an den Stoppcodons UAA, UGA und UAG. Normalerweise gibt es keine tRNA mit den entsprechenden Anticodons. Die Stoppcodons werden jedoch von Terminationsfaktoren erkannt, deren Bindung an das Stoppcodons das Enzym Peptidyltransferase aktiviert, das die Bindung zwischen tRNA und Polypeptid hydrolysiert, so daß sich das Polypeptid vom Ribosom löst. Das Ribosom dissoziiert in seine Untereinheiten, so daß der Zyklus von neuem beginnen kann.

Schon während der Synthese faltet sich das Peptid spontan und nimmt eine bestimmte dreidimensionale Struktur an, die im wesentlichen durch die Primärstruktur der Aminosäuren gegeben ist.

Nach der Translation werden viele Proteine noch sekundär modifiziert:

• Am Aminoende werden häufig eine oder mehrere Aminosäuren durch Aminopeptidasen abgespalten, so daß die Proteine mit Methionin beginnen
• Zahlreiche Proteine werden als Vorläufer synthetisiert und anschließend gespalten. Erst das modifizierte Spaltprodukt ist aktiv (z.B. Proinsulin ® Insulin). Bei bestimmten Viren (z.B. Poliovirus) werden zunächst sog. Polyproteine synthetisiert, die anschließend in mehrere verschiedene Proteine gespalten werden. Sekretorische und Membranproteine besitzen am Aminoterminus meistens ein Signalpeptid von 16-30 Aminosäuren, das beim Durchtritt durch die Membran abgespalten wird
• Durch Oxidation von zwei Cysteingruppen können Disulfidbrücken gebildet werden
• Bestimmte Aminosäuren können modifiziert werden (z.B. Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Serin, Threonin und Tyrosin, Acetylierung von Lysin)
• Glycoproteine entstehen durch Bindung von Zuckerketten an bestimmte Aminosäuren (Asparaginsäure, Serin, Threonin)
• Prosthetische Gruppen und Coenzyme, die für die Funktion unerläßlich sind, werden an die Proteine gebunden

Die Proteinsynthese kann mit verschiedene Inhibitoren spezifisch gehemmt werden. Puromycin entspricht in seiner Struktur einem tRNA-Molekül, das mit einer Aminosäure beladen ist. Es wird deshalb in die wachsende Polypeptidkette eingebaut und führt zu einem verfrühten Kettenabbruch, weil keine weitere Aminosäure mehr an Puromycin angehängt wird. Chloramphenicol und Cycloheximid sind Inhibitoren der Peptidyltransferase. Cycloheximid wirkt nur auf die cytoplasmatischen Ribosomen der Eukaryoten, Chloramphenicol nur auf prokaryotische Ribosomen von Mitochondrien und Chloroplasten – ein weiterer Hinweis darauf, daß die Mitochondrien und Chloroplasten von Prokaryoten abstammen.

2.6 Mutation

Unter Mutation versteht man ganz allgemein eine Veränderung der genetischen Information; chemisch betrachtet ist sie eine Veränderung der Sequenz oder Anzahl der Nucleotide in der DNA. Mutationen lassen sich klassifizieren als Genmutationen (betreffen einzelne Gene), Strukturmutationen (verändern Chromosomenabschnitte) und Chromosomenmutationen (beeinflussen die Anzahl der Chromosomen). Mutationen sind i.d.R. stabil und werden auf die Tochtergeneration vererbt. Im Gegensatz zur Mutation ist die Modifikation als umweltbedingte, nicht erbliche Veränderungen eines Organismus definiert. Mutation und Modifikation lassen sich in bestimmten Fällen nur schwer gegeneinander abgrenzen. Das gilt v.a. für Dauermodifikationen, die über eine begrenzte Anzahl von Generationen Bestand haben.

2.6.1 Nachweis der Mutationen

a. Nachweisverfahren bei Haploiden

Bei haploiden Organismen mit einfachem Genom zeigt sich die Wirkung einer Mutation unmittelbar, während bei diploiden Organismen mit doppeltem Chromosomensatz die Manifestation einer Mutation häufig durch die Anwesenheit des homologen, nichtmutierten Gens unterdrückt wird (Dominanz des normalen und Rezessivität des mutierten Gens).
Eine direkte Selektion von Mutanten ist bei Haploiden möglich (z.B. Penicillinresistenzmutanten). Zellen mit der Mutation vermehren sich zu Kolonien (Klone).
Die Entstehung der resistenten Zellen wird durch zwei unterschiedliche Hypothesen erklärt:

1. Mutationshypothese: ein Bakterium kann unabhängig vom selektiven Agens mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit pro Zellengeneration von sensitiv zu resistent mutieren. Die Nachkommen einer mutierten Zelle sind resistent, sofern keine Rückmutation auftritt.
2. Adaptationshypothese: das selektive Agens induziert die erbliche Resistenz selbst; das kommt einer Vererbung erworbener Eigenschaften gleich.

Der Unterschied zwischen den beiden Hypothesen läßt sich auf die Frage reduzieren, ob die Resistenz unabhängig vom slektierenden Agens auftritt oder von diesem induziert wird. Das Experiment (Fluktuationstest) zeigt, daß die Mutationshypothese die zutreffende der beiden ist.

b. Nachweisverfahren bei diploiden Zellen

Bei Diploiden sind viele Mutationen rezessiv, manifestieren sich also nur in homozygoten Trägern. Die verschiedenen Mutationsformen eines Gens werden als Allele bezeichnet. Zum Nachweis werden drei Kreuzungen (Parentalgeneration, Filial-1- und Filial-2-Generation) benötigt. Das dabei entstehende Phänotypenmuster entspricht den Mendelschen Regeln (vgl. Abb. 2.14).

Abb. 2.14: Kreuzungsschema zum Nachweis von rezessiven Lethalmutationen auf dem X-Chromosom von Drosophila. Basc ist ein Balancer-Chromosom, das den dominanten Marker Bar und die rezessive Augenfarbmutante white-apricot trägt. Die nachzuweisende Mutation ist mit m bezeichnet. F1, F2 Filialgenerationen 1 und 2, P Parentalgeneration. Farbe und Form der Augen sind für die verschiedenen F2-Genotypen angegeben. Bei der Aufstellung von Kreuzungsschemata werden dominante Allele mit großen Anfangsbuchstaben, rezessivemit kleinen Buchstaben bezeichnet; das Wildtyp-Allel wird in der Regel mit einem (+)-Zeichen gekennzeichnet.

2.6.2 Spontane Mutationen

Mutationen treten als seltene Ereignisse in der Natur spontan auf. Diese Häufigkeit kann für ein Gen stark schwanken und wird als Mutationsrate gemessen. Bei höheren Organismen mit sexueller Fortpflanzung versteht man unter Mutationsrate die Anzahl der Mutationen pro Gamet und Generation. Die spontane Mutationsrate variiert bei verschiedenen Organismen und Genen beträchtlich und liegt i.d.R. zwischen 10^-4 bis 10^-9, d.h., das Genom ist sehr stabil. Ursachen für "spontane" Mutationen können sein:

• UV-Bestrahlung
• konsmische Strahlung
• Temperaturschwankungen
• mutagene Substanzen
• endogene Faktoren (begrenzte Stabilität des DNA-Moleküls; Replikationsfehler, die nicht repariert werden können)

Eine der Hauptursachen liegt in den sog. Insertionssequenzen und Transposons, die sich als "hüpfende" Gene an verschiedenen Stellen ins Genom integrieren und dort Mutationen auslösen können. Spontane Mutationen ereignen sich nicht nur während der Zellvermehrung, sondern auch in stationären Phasen des Zellzyklus.

2.6.3 Induktion von Mutationen

Experimentell können Mutationen mit physikalischen, chemischen und biologischen Methoden induziert werden.

a. Ionisierende Strahlen

Röntgen- und g-Strahlung wirken ionisierend und können dabei chemisch reaktive Radikale erzeugen. Die Abhängigkeit der Mutationsrate von der Strahlendosis ist für das X-Chromosom von Drosophila in Abb. 2.15 wiedergegeben. Dabei steigt die Frequenz der induzierten rezessiven Letalmutationen pro getestetem Chromosom im Bereich zwischen 0,05 und 25 Gy linear mit der Strahlendosis an.
Säugetiere reagieren im Vergleich zu Drosophila viel empfindlicher auf ionisierende Strahlen. Beim Menschen liegt die letale Dosis LD₅₀ bei 4-4,5 Gy.

b. Ultraviolettes Licht

UV-Strahlen wirken v.a. bei Bakterien mutagen, bei höheren Organismen ist v.a. die Haut betroffen. Die wirksamste Wellenlänge liegt bei ca. 260 nm (Absorptionsmaximum der DNA). Die wesentliche photochemische Wirkung der UV-Strahlung liegt in der Induktion von Pyrimidindiemeren. Dabei werden zwei im gleichen Strang benachbarte Pyrimidine (am häufigsten zwei Thymidinreste) kovalent gebunden (Abb. 2.16).

physikalische Mutagenzien	Wirkung auf die DNA
ionisierende Strahlung	Bildung von Radikalen
Röntgen-, a-, b-, g-, Neutronenstrahlung	Brechen der Phosphodiesterbindung Kovalente Verbindung der beiden DNA-Stränge
UV-Strahlung
Hitze	Depurinierung

Solche Dimere hemmen die DNA-Synthese, falls sie nicht durch spezielle Enzyme repariert werden, wobei während der Reperatur mit bestimmter Wahrscheinlichkeit Fehler auftreten. Es sind verschiedene Reperaturmechanismen nachgewiesen

• Photoreaktivierung: ein Enzymsystem, das Pyrimidindimere spaltet; dazu erforderlich ist eine Bestrahlung mit sichtbarem Licht im Bereich von 310-400 nm
• Excisionsreaktivierung: Ein DNA-Strang, der das Thymindimer enthält wird von einer bestimmten Endonuclease durch Spaltung der Phosphidiesterbindung aufgeschnitten. Anschließend schneidet eine Endonuclease das Dimer und benachbarte Nucleotide aus (Excision). Die fehlenden Nucleotide werden durch DNA-Polymerasen wieder eingesetzt (Komplementärstrang als Matrize); schließlich wird das reparierte Segment wieder verknüpft
• Postreplikationsreparatur: wirkt erst nach der Replikation.

Mutationen, die diese drei Reparaturmechanismen inaktivieren, führen zu stark erhöhten Mutationsraten nach UV-Bestrahlung. Selbst bei intakten Reparaturmechanismen treten Mutationen auf, da die genannten Systeme nicht absolut fehlerfrei funktionieren.
Beim Menschen ist die Xeroderma pigmentosa (Überempfindlichkeit gegen UV-Strahlung und Sonnenlicht) bekannt, die sich in der Bildung brauner Flecken in der Haut äußert und durch eine Mutation verursacht wird, die ein Enzym für Excisionsreparatur inaktiviert. Durch die erhöhte Mutationsrate nach UV-Bestrahlung entsteht häufig Krebs.

c. Hitze

Hohe Temperaturen, v.a. zusammen mit niedrigem pH, führt zu Depurinierung der DNA, d.h. zur Spaltung der Bindung zwischen den Purinbasen und der Desoxyribose und zur Freisetzung der Purine. Bei der nächsten DNA-Replikation werden die fehlenden Purine durch beliebige Basen ersetzt, so daß Mutationen entstehen.

d. Chemische Mutagenzien

Bestimmte Chemikalien sind besonders mutagen. Entweder wirken sie direkt auf die DNA oder erzeugen indirekt mutagene Stoffwechselprodukte. Zudem können sie auf den Zellteilungsmechanismus einwirken. Dazu gehören

• salpetrige Säure
• Hydroxylamin
• alkylierende Substanzen (z.B. bei Bakterien Nitrosoguanidin und Ethylmethansulfat)

Der genaue chemische Wirkungsmechanismus ist schwierig zu bestimmen, da Mutationen, bezoge auf die Anzahl der Basenpaare in der DNA, seltene Ereignisse sind. Der am häufigsten in vitro beobachtete chemische Wirkungsmechanismus braucht deshalb nicht unbedingt mit dem Mechanismus in vivo übereinzustimmen.

chemische Mutagenzien	Auswirkung auf die DNA
salpetrige Säure HNO2
Hydroxylamin NH2-OH
alkylierende Substanzen: H3C-CH2-O-SO2-CH3	Transition, Transversion, Deletion
"Nitrosoguanidin"	Alkylierung der Basen - löst vor allem im Bereich der Replikationsgabel Mutationen aus
basenanaloge Verbindungen	A-T ® A-BU ® G-BU ® G-C G-C ® G-BU ® A-BU ® A-T       AT Û GC   Transitionen
interkalierende Substanzen	Mutagens, Addition

Mutagenitätstests haben ergeben, daß 90% aller carcinogenen Substanzen auch mutagen wirken. Zwei besonders potente Carcinogene – Aflatoxin B, das Gift des Schimmelpilzes und Bezopyren aus dem Tabakrauch – sind an sich zwar nicht mutagen, werden jedoch in der Leber von bestimmten Enzymen zu stark mutagenen Verbindungen umgewandelt.

e. Biologische Induktion von Mutationen

Erst in neuer Zeit sind Transposons und Retroviren allgemein als wichtige mutagene Agenzien erkannt worden. Die hüpfenden Gene können sich an zahlreichen Stellen des Genoms ihres Wirtes einfügen und damit eine codierende Sequenz unterbrechen oder die Genregulation stören. Nach ihrer Insertion erzeugen sie oft sekundäre Mutationen wie Deletionen und Inversionen.

f. Gerichtete Mutation

Der Gentechniker kann durch bestimmte Methoden der Gentechnik Mutationen gezielt in einem bestimmten Basenpaar erzeugen. Dazu muß das Gen zunächst isoliert, in vitro mutiert und dann wieder in den Organismus eingesetzt werden.

2.6.4 Genmutationen

Genmutationen betreffen einzelne Gene, im Extremfall ein einzelnes Basenpaar (Punktmutation). Die molekularen Grundlagen einer Punktmutation wurden erstmals bei der menschlichen Sichelzellenanämie aufgeklärt. Im Vergleich der normalen Aminosäuresequenz des Hämoglobin A (HbA) und Sichelzellenhämoglobin (HbS) zeigt sich anstelle der Glutaminsäure in Stellung 6 ein eingebautes Valin. Daher muß im genetischen Code an der entsprechenden Stelle ein Glutaminsäure-Codon (GAA oder GAG) zu einem Valin-Codon (GTA oder GTG) mutiert sein. Die Substitution eines einzelnen Basenpaares kann also eine Erbkrankheit auslösen, die zu einem frühen Tod führt.
Man unterscheidet verschiedene Genmutationen:

• Missense-Mutation: durch Transitionen und/oder Transversionen wird bei der Proteinsynthese eine falsche Aminosäure eingebaut
• Stumme Mutation: eine Basenpaarsubstitution, bei der trotzdem die richtige Aminosäure eingebaut wird
• Nonsense-Mutation: führt zu einem Kettenabbruch bei der Transposition der DNA
• Rasterverschiebungsmutation: meist durch Deletion verursachte Verschiebung des Leserasters in der DNA
• konditionale Mutationen: wirken sich unter restriktiven Umweltbedingungen aus; unter permissiven Bedingungen sind die Träger jedoch normal lebensfähig wie der Wildtyp

2.6.5 Strukturmutationen

Strukturmutationen sind Chromosomenabberationen, die man unter günstigen Bedingungen im Lichtmikroskop erkennen kann. Unter bestimmten Bedingungen (z.B. UV- oder ionisierende Strahlung, bestimmte chemische Mutagenzien, Nucleasen) kann das DNA-Molekül gespalten werden, so daß daß Chromosomenbrüche entstehen. Bei Trägern z.B. der Franconis-Anämie ist die Häufigkeit spontaner Chromosomenbrüche stark erhöht. Acentrische Fragmente (ohne Centromer) werden bei der Mitose nicht zu den Spindelpolen gezogen, bleiben im Cytoplasma liegen und gehen verloren.
Abb. 2.18 zeigt mögliche Chromosomenabberationen.

Abb. 2.18: Strukturmutationen.

2.6.6 Chromosomenmutationen

Chromosomenmutationen können entweder ganze Chromosomensätze betreffen, so daß sich die resultierende Chromosomenzahl als ganzzahliges Vielfaches der haploiden Grundzahl ergibt (Euploidie), oder einzelne Chromosomen bzw. Chromosomengruppen zahlenmäßig verändern (Aneuploidie). Beim Menschen sind Chromosomenmutationen von großer Bedeutung, denn mindestens 15% aller Schwangerschaften führen zu einem spontanen Abort. Nach cytologischen Untersuchungen weisen ca. 37% der letalen Föten Chromosomenmutationen auf. Unter den Neugeborenen haben etwa 0,5% Chromosomen- und Strukturmutationen. Chromsomenmutationen beruhen i.d.R. auf einer Fehlverteilung der Chromosomen während Meiose oder Mitose. Die Fehlverteilung der Chromosomen (Nondisjunction) wurde erstmals von BRIDGES (1914) aus den Geschlechtschromosomen von Drosophila nachgewiesen. Abb. 2.21 zeigt die Ergebnisse.

Abb. 2.21: Fehlverteilung der Geschlechtschromosomen bei Drosophila-. Das väterliche X-Chromosom ist farbig gekennzeichnet und trägt das Wildtyp-Gen (w+) für rote Augen. Die mütterlichen X-Chromosomen tragen das rezessive Markierungsgen white (w) für weiße Augenfarbe. Die Ausnahmetiere sind entsprechend ihrer Augenfarbe hervorgehoben. A: Primäre Fehlverteilung B: Sekundäre Fehlverteilung

Es gibt folgende Typen der Chromosomenmutationen:

• Fehlverteilung der Chromosomen (Nondisjuction)
  Dabei werden bei Mitose oder Meiose durch den Spindelapparat die homologen Chromosomen nicht gleichmäßig auf die beiden Tochterkerne verteilt.
• Aneuploidie
  Bei Diploiden Organismen wird das Fehlen eines Chromosoms als Monosomie, das zusätzliche zusätzliche Auftreten eines homologen Chromosoms als Trisomie bezeichnet. Beide Anomalien treten unter den menschlichen Erbkrankheiten gehäuft auf. Die Störung der Genbalance wirkt sich v.a. bei den Autosomen aus, so daß viele autosomale Tri- oder Monosomien letal sind. Bei den Geschlechtschromosomen herrschen besondere Verhältnisse wegen des Dosiskompensationsmechanismus, der die Ungleichverteilung der X-Chromosomen zwischen den Geschlechtern ausgleicht. Treten zusätzliche X-Chromosomen auf, werden alle bis auf eines während der Embryonalentwicklung inaktiviert. Das kurze, zum Y-Chromosom homologe Segment des X-Chromosoms wird allerdings nicht inaktiviert, was sich auf den Phänotyp auswirkt (vgl. weiter die entsprechenden Kapitel in der Humangenetik!)
• Euploidiemutationen
  Mutationen, die die Gesamtzahl ganzer Chromosomensätze verändern, führen zu einer Veränderung der Gendosis. Innerhalb bestimmter Grenzen nimmt das Volumen der Zellen mit der Anzahl der Chromosomensätze zu. Nach Euploidiemutationen ergeben sich häufig Probleme bei der Meiose, da diese im Prinzip auf der Paarung von zwei – und nur zwei – homologen Chromosomen beruht. Euploidiemutationen spielen v.a. bei Pflanzen eine wichtige Rolle
• Haploidie
  Bei Diploiden sind Mutationen, die zu Haploidie führen, meist nicht oder nur begrenzt lebensfähig.
• Triploidie und Polyploidie
  Bei Triploidien kommt es in der Meiose zu Unregelmäßigkeiten, da sich nur zwei von drei homologen Chromosomen ordnungsgemäß paaren und auf die Tochterkerne verteilt werden, so daß außer haploiden und diploiden auch aneuploide Kerne entstehen können. Triploide Organismen weisen daher eine reduzierte Fertilität auf. Sie können aus einem diploiden Gameten, der keine Reduktionsteilung durchlaufen hat, und einem haploiden (nomalen) Gameten oder aus einer Kreuzung von einem tetraploiden mit einem diploiden Stamm hervorgehen. Beim Menschen ist Triploidie relativ häufig, doch sterben meistens die Föten frühzeitig ab (spontane Aborte), oder der Tod tritt kurz nach der Geburt ein. Bei polyploiden Organismen unterscheidet man autopolyploide Arten, bei denen nur das Genom einer Spezies vermehrt ist, und allopolyploide Arten, bei denen zwei Arten oder sogar zwei Gattungen beteiligt sind. Polyploidie ist bei Tieren eher selten, bei Pflanzen aber weit verbreitet. Bei Tieren ist sie oft mit parthenogenetischer Fortpflanzung gekoppelt. In somatischen Geweben kommen häufig polyploide Zellen vor, die durch Endomitose entstehen (z.B. in der Leber von Säugetieren, dort findet man 8n-m, 16n- und sogar 32n-Zellen).

2.6.7 Rückmutation und Suppression

Eine Mutation kann auf verschiedene Weise wieder rückgängig gemacht werden:

Bei der Entschlüsselung des genetischen Codes wurden am rII-Locus des Bakteriophagens T4 drei Nonsense-Mutationen gefunden, die den Terminationscodons UAG UAA und UGA entsprechen und jeweils von entsprechenden Suppressorgenen supprimiert werden. Die Mutanten – bzw. die entsprechenden Suppressoren – werden mit den Trivialnamen amber für UAG, ocker für UAA und opal für UAG bezeichnet. Während bei Nonsense-Mutationen (in nichtpermissiven Stämmen) ein vorzeitiger Kettenabbruch bei der Proteinsynthese erfolgt, wird in Suppressorstämmen ein Protein normaler Kettenlänge gebildet, das jedoch an der Stelle des Nonsense-Codons eine für das entsprechende Suppressor-Gen typische Aminosäure enthält.
Sequentzierungsstudien haben ergeben, daß die drei Nonsense-Codons auch als natürliche Terminationscodons funktionieren. Es ist deshalb überraschend, daß eine Suppressormutation nicht letal ist, da die normale Termination bei allen Proteinen, die mit dem betreffenden Terminationscodon enden, unterbleiben sollte. Suprressorstämme verfügen jedoch meist über zusätzliche tRNA-Gene. Außer dem Terminationscodon spielen auch andere Faktoren bei der Temination eine wichtige Rolle. Häufig findet man zudem zwei verschiedene Terminationssignale hintereinander am Ende eines Gens. Nosense-Suppressoren wurden auch bei Hefen und Nematoden gefunden.

2.7 Komplementation

Mutationen können durch einen Komplementationstest (cis-trans-Test) bestimmten Genen zugeordnet werden. Das Prinzip der Komplementation zeigt Abb. 2.23 anhand von drei rezessiven Mutanten, m1, m2 und m3. Der cis-trans-Test erlaubt es festzustellen, ob diese Mutanten Allele des gleichen Gens sind oder ob sie verschiedenen Genen zuzuordnen sind. Aufgrund dieses Tests kann das Gen als eine Funktionseinheit (Cistron) definiert werden, die den Wildphänotyp erzeugt. Mutationen in verschiedenen Cistrons komplementieren einander, während sich Mutationen im gleichen Cistron nicht zu komplementieren vermögen.

Abb.2.22: Komplementationstest. Die rezessiven Mutationen (m1, m2, m3) in den Genen a, b und c werden heterozygot in der cis-Anordnung (auf dem gleichen Chromosom) und in trans-Stellung (auf verschiedenen Chromosomen) auf ihren Phänotyp getestet. Entsteht in der trans-Stellung der Wildphänotyp A, komplementieren die beiden Mutationen, betreffen also verschiedene Gene (Funktionseinheiten). Zeigen trans-heterozygote Tiere jedoch den Mutantenphänotyp B, komplementieren die beiden Mutanten nicht und betreffen somit das gleiche Gen.

Intragene Komplementation: In manchen Fällen komplementieren auch verschiedene Allele, die im gleichen Gen oder Cistron liegen. In diesen Fällen ist die Komplementation aber stets unvollständig, so daß in der trans-Konfiguration im Vergleich zum Wildtyp eine stark reduzierte Enzymaktivität gemessen wird. Intragene Komplementation wurde bisher nur bei Proteinen beobachtet, die aus zwei oder mehr Untereinheiten bestehen. Sie beruht auf einer Wechselwirkung zwischen den mutierten Polypeptidketten. Der Defekt in der Faltung der einen Kette kann durch die Mutation in der anderen Kette partiell korrigiert werden, so daß das multimere Protein wenigstens teilweise aktiv ist.

2.8 Rekombination

2.8.1 Segregation von Allelen und unabhängige Aufspaltung

Die grundlegenden Gesetzmäßigkeiten der Vererbung wurden von Mendel erkannt, der postulierte, daß die Vererbung auf einzelnen diskreten Erbfaktoren beruht. Er leitete die Existenz von partikulären Zellelementen (den heutigen "Genen") ab, die den untersuchten Merkmalen zugrunde liegen.
Kurz nach der Wiederentdeckung der Mendelschen Gesetze zeigten Morgan und andere Genetiker, daß die Gesetze für diploide Organismen mit geschlechtlicher Fortpflanzung allgemein gültig sind (vgl. Abb. 2.24 für Drosophila).

Abb. 2.24: Monohybrider Erbgang: Segregation von Allelen. Die Mutation ebony (e) erzeugt bei Drosophila dunkle Körperfarbe und ist rezessiv zum Wildtyp-Allel (e+ > e). Die von der Parentalgeneration (P) abstammende erste Filialgeneration (F1) ist uniform (1. Mendelsches Gesetzt), in der F2 spalten sich Genotypen im Verhältnis 1:2:1 auf (2. Mendelsches Gesetz). Die homologen Chromosomen sind durch zwei horizontale Striche angegeben.

Die Abbildung 2.24 zeigt einen monohybriden Erbgang, bei dem nur ein Gen in zwei Allelen beobachtet wird. Es ergibt sich in der F2-Generation eine Verteilung im Verhältnis von 1:2:1.
Ein dihybrider Erbgang ist in Abb. 2.25 gezeigt. Die beiden beobachteten Gene liegen auf verschiedenen Chromosomen, sind also nicht gekoppelt. In der F2-Generation ergibt die Verteilung ein Verhältnis von 9:3:3:1. Dabei entstehen auch neue Kombinationen wie, z.B. Doppelmutanten, die beide elterliche Mutationen in sich vereinigen. Dieser Vorgang wird allgemein als Rekombination bezeichnet.

Abb. 2.25: Dihybrider Erbgang: Unabhängige Aufspaltung von nichtgekoppelten Genen. Die rezessiven Mutationen vestigial (vg, stummelflügelig) und ebony (e, dunkle Körperfarbe) sind nicht gekoppelt (d.h. auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert). Die F1 ist heterozygot und uniform. In der F2 spalten die beiden Mutationen unabhängig voneinander auf: Es entstehen vier phänotypisch verschiedene Nachkommenklassen im Verhältnis 9:3:3:1.

Die Segregation der Gene läßt sich auf Grund der Chromosomentheorie der Vererbung und des Verhaltens der Chromosomen in der Meiose erklären. Die Gene eines Genpaares sind in homologen Chromosomen lokalisiert. In der Prophase der ersten meiotischen Teilung legen sich die homologen Chromosomen parweise aneinander und wandern anschließend zu entgegengesetzten Spindelpolen, so daß die Partner des Genpaares voneinander getrennt werden. Dabei ist die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Gen zum einen oder andern Spindelpol wandert gleich groß: Die Verteilung erfolgt zufällig. Da verschiedene Chromosomenpaare in der Meiose unabhängig voneinander segregieren, spalten Gene auf verschiedenen Chromosomen unabhängig voneinander auf. Aufgrund der Mendelschen Gesetze handelt es sich um statistische Gesetzmäßigkeiten, und die beobachteten Zahlenverhältnisse zeigen eine relativ breite Streuung.

2.8.2 Kopplung und Rekombination

Aufgrund der Chromosomentheorie der Vererbung ist zu erwarten, daß Gene, die auf dem gleichen Chromosom liegen, nicht unabhängig voneinander, sondern gemeinsam segregieren (Kopplung). Durch Rekombination kann die Kopplung jedoch durchbrochen werden. Dies läßt sich leicht demonstrieren (Abb. 2.26).

Abb. 2.26: Kopplung und Rekombination. Die homologen Chromosomen sind durch horizontale Striche dargestellt. Das Parental-€ ist homozygot für die beiden Markierungsgene purple (pr) und vestigial (vg), die die Augenfarbe bzw. Flügelausbildung beeinflussen. Das P- ist homozygot für die beiden Wildtypallele (pr+ und vg+). Die F1 ist uniform und zeigt den Wildphänotyp, da die Wildtyp-Allele dominant sind. Nach Rückkreuzung der F1-Nachkommen mit homozygot rezessiven Fliegen erscheinen unter den Nachkommen der F1-‚ Rekombinanten, die nur noch eines der beiden Markierungsgene tragen (entweder pr oder vg). Die Zahl der Rekombinanten ergibt den Rekombinationswert (in Centi-Morgan = %). Bei Drosophila-� kommt keine Rekombination vor, die beiden Markierungsgene erscheinen absolut gekoppelt.

Man spricht im Falle des Drosophila- von absoluter Kopplung. Demgegenüber treten in der Nachkommenschaft des heterozygoten F1-€ außer den beiden Parentaltypen auch Rekombinanten (vg pr+ und vg+ pr) auf, die in P und F1 fehlen. Die Frequenz dieser Rekombinanten wird im Rekombinationswert erfaßt, der die Zahl der Rekombinanten bezogen auf die Gesamtzahl der Nachkommen angibt. 1% Rekombinationswert wird als 1 Centi-Morgan (CM) definiert. Die Frequenzen der beiden Rekombinantenklassen im gewählten Beispiel ist etwa gleich, was auf einen reziproken Genaustausch schließen läßt. Die Rekombination der Markierungsgene beruht auf einem Crossover-Vorgang in der Meiose (vgl. Abb. 2.27). Dabei werden Chromosomensegmente mit den entsprechenden Markierungssegmenten reziprok vertauscht. Der Crossover-Vorgang manifestiert sich cytologisch in der Ausbildung von Chiasmata während der meiotischen Prophase.

Abb. 2.27: Reziproker Austausch (Crossover) in der Meiose: A ohne Crossover, B mit Crossover. In der Prophase der Meiose I sind die Chromosomen bereits verdoppelt und legen sich paarweise aneinander, wobei stets homologe Chromosomenabschnitte gepaart sind. Mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit kommt es zum reziproken Austausch (Crossover) und damit zur Rekombination zwischen den beiden Markierungsgenen a und b. Die Chromosomen sind in verschiedener Farbe, das Centromer als offener Kreis wiedergegeben. P = parentale Chromosomen R = rekombinante Chromosomen MI, MII Meiose I und II

Aufgrund der beobachteten Unterschiede im Rekombinationswert verschiedener Gene ist dieser ein Maß für den Abstand zweier Gene auf dem Chromosom. Wenn nämlich Crossover an jedem Ort des Genoms mit gleicher Wahrscheinlichkeit stattfindet, ist zu erwarten, daß die Anzahl der Crossover dem Abstand zwischen zwei Genen proportional ist. Diese Hypothese ist leicht mit einem sog. Dreipunkteversuch zu belegen.
Durch eine Reihe solcher Dreipunktversuche mit verschiedenen Markierungsgenen konnte Sturtevant nachweisen, daß die Gene linear auf dem Chromosom angeordnet sind, und Rekombinationskarten mit der korrekten Genreihenfolge ermitteln (Abb. 2.29). Rekombinations- und Deletionskartierung stimmen in der Genreihenfolge miteinander überein. Durch Isolation der entsprechenden DNA-Segmente kann zudem gezeigt werden, daß die Rekombinationskarte auch der physikalischen DNA-Karte entspricht.

Abb. 2.29: Genkarte des X-Chromosoms von Drosophila melanogaster. Genlocus in Centi-Morgan.

2.8.3 Phyiskalischer Austausch von Chromosomensegmenten

Der physikalische Austausch von Chromosomensegmenten beim Crossover ist von Stern bei Drosophila mit Hilfe genetisch und cytologisch markierter Chromosomen untersucht worden (vgl. Abb. 2.30).

Abb. 2.30: Physikalischer Austausch von Chromosomensegmentenn bei der Rekombination. Alle beteiligten Chromosomen sind morphologisch markiert. XP besteht aus dem proximalen Teil des X-Chromosoms und trägt die Marker car (carnation) und B (bar). Der distale Teil des X-Chromosoms (XD) ist auf das 4. Chromosom transloziert. Die Centromere sind als kleine Kreise dargestellt. Das zweite X-Chromosom der parentalen ‚ trägt infolge einer Translokation zusätzlich den langen Arm eines Y-Chromosoms (YL). Das P- besitzt cytologisch normale X- und Y-Chromosomen; das X-Chromosom trägt den rezessiven Marker car. Wenn im € während der Meiose (M) eine Rekombination zwischen den Markern car und B auftritt, entstehen cytologisch "neue" Chromosomentypen (farbig gerastert), die sich nur durch den physikalischen Austausch von Chromosomenabschnitten erklären lassen. In der F1 sind nur die ‚ eingezeichnet, die Y-Spermien (Y) werden nicht weiterverfolgt.

Wie man sieht, ist die Rekombination also mit einer cytologischen Rekombination verbunden, d.h. mit einem physikalischen Austausch von Chromosomensegmenten.

2.8.4 Unterdrückung der Rekombination durch Strukturmutationen

Damit eine Rekombination stattfinden kann, müssen die homologen Chromosomen in der Meiose gepaart sein. Strukturen, die eine Chromosomenpaarung erschweren oder verhindern, unterdrücken die Rekombination. Solche Strukturmutationen werden deshalb für die Konstruktion von Balancer-Chromosomen verwendet, die die Rekombination verhindern sollen. Wie aus Abb. 2.31 ersichtlich, führt bei Heterozygoten ein einfaches Crossover innerhalb einer paracentrischen Inversion zu einem dicentrischen Chromosom (mit 2 Centromeren) und einem acentrischen Chromosomenfragment.

Abb. 2.31: Crossover bei Inversionsheterozygoten. A: Paracentrische Inversion. B: Pericentrische Inversion. Bei der parazentrischen Inversion (A1) entsteht infolge des Crossovers ein acentrisches Fragment (ohne Centromer) und eine dicentrische Chromosomenbrücke (A2), die in der Anaphase zerreißt, wenn die beiden Centromere zu den Spindelpolen gezogen werden. Bei der pericentrischen Inversion (B1) enthalten beide Rekombinationschromosomen sowohl eine Deletion als auch eine Duplikation (B2). Die Buchstaben symbolisieren Markierungsgene; die Centromere sind als kleine Kreise dargestellt.

Das dicentrische Fragment bildet in der Anaphase der Kernteilung eine "Chromosomenbrücke", die an irgendeiner Stelle reißt, da die beiden Centromere zu entgegengesetzten Spindelpolen gezogen werden. Da acentrische Fragment bleibt in der Anaphase liegen, da es keine Ansatzstelle für Spindelfasern besitzt, und geht nach der erneuten Bildung der Kernmembran im Cytoplasma verloren. In beiden rekombinanten Chromosomen gibt es also Deletionen und z.T. auch Duplikationen, so daß die daraus entstehenden Zygoten nicht lebensfähig sind. Trotzdem beobachtet man sowohl bei Drosophila als auch bei Pflanzen kaum eine erhöhte Letalität bei Heterozygoten für eine paracentrische Inversion. Wie cytologische Untersuchungen zeigen, ist dies darauf zurückzuführen, daß die abberanten (rekombinanten) Chromosomen in die Polkerne abgestoßen werden und nur die normalen (parentalen) Chromosomen in den Eikern gelangen. Deshalb ist die Rekombination bei Heterozygoten für eine paracentrische Inversion scheinbar unterdrückt. Ein doppeltes Crossover innerhalb der Inversion hat cytologisch keine negativen Konsequenzen, wenn nur zwei Chromatiden beteiligt sind, so daß z.B. Markierungsgene dennoch durch Rekombination in Inversionen eingeführt werden können. Pericentrische Inversionen (Abb. 2.31B), bei denen das Centromer innerhalb der Inversionsschleife liegt, setzen die Rekombinationsfrequenz aus anderen Gründen herab. Ein einfaches Crossover innerhalb der Inversionsschleife führt in diesem Fall zur Bildung von Duplikationen bzw. Deletionen, die eine erhöhte Sterblichkeit der Zygoten verursachen. Damit wird wiederum der Anteil der Rekombinanten unter den lebensfähigen Nachkommen stark verringert.

2.8.5 Intragene Rekombination und molekulare Mechanismen

Durch Feinstrukturanalyse kann gezeigt werden, daß die klassische Vorstellung, die Gene seien auf dem Chromosom wie Perlen auf einer Schnur aufgereiht und Rekombination sei wie Austausch einzelner Perlen zwischen den Schnüren, nicht ganz zutrifft, denn es findet auch intragene Rekombination statt.
Rekombination zwischen zwei weit voneinander entfernten Markierungsgenen ist reziprok und führt zu einer 4:4-Aufteilung. Diese reziproke Rekombination wird als Crossover bezeichnet. Untersucht man jedoch die seltenen Rekombinationsereignisse zwischen zwischen zwei Mutanten a¹ und a² des gleichen Gens, die sehr eng gekoppelt sind, so findet man einen hohen Anteil an (6:2)-Asci (Abb. 2.33).

Abb. 2.33: Intragene Rekombination beim Schlauchpilz Neurospora. A: Reziproker Austausch (Crossover). B: Konversion. C: Konversion mit postmeiotischer Segregation. a1, a2 = verschiedene Allele des gleichen Gens MI, MII = meiotische Teilungen Mi = Mitose Eine horizontale Linie repräsentiert eine Doppelhelix. Die Aufspaltungsverhältnisse a2 zu + sind angegeben

Diese nichtreziproke Form der intragenen Rekombination bezeichnet man als Genkonversion. Außerdem treten noch (5:3)-Asci auf, die darauf hindeuten, daß in diesem Fall die Segregation erst nach der Meiose in der darauffolgenden Mitose erfolgt (postmeiotische Segregation).

Es sind verschiedene Modelle für den molekularen Mechanismus der Rekombination und das Auftreten von Crossover, Genkonversion und postmeiotische Segregation vorhanden, die alle auf der Annahme basieren, daß eine Chromatide aus einer DNA-Doppelhelix bestehen. In der meiotischen Prophase kann man daher von 4 gepaarten Doppelhelices ausgehen (Abb. 2.34).

Abb. 2.34: Modell des Mechanismus der Rekombination. Eine horizontale Linie repräsentiert einen DNA-Einzelstrang. Es sind nur die beiden an der Rekombination beteiligten DNA-Doppelstränge wiedergegeben.

Im Verlauf der Rekombination brechen einzelne DNA-Stränge und werden mit anderen neu verknüpft. Da während der Meiose i.d.R. keine Mutationen entstehen, muß dieser Vorgang mit großer Präzision erfolgen und zusätzlich durch Reparaturmechnismen abgesichert sein. Die postmeiotische Segregation weist darauf hin, daß bei abberanter Segregation (z.B. 5:3) am Ende der Meiose DNA-Moleküle vorliegen, die aus zwei verschiedenen, nicht komplementären Strängen bestehen (Heteroduplexe).

Die intragene Rekombinationsanalyse erlaubt es, den Abstand von Mutationen innerhalb eines Gens zu bestimmen. Das Gen läßt sich in zahlreiche Mutationsorte auflösen, deren Abstand der Rekombinationsfrequenz proportional ist. Das Gen erscheint somit prinzipiell nicht mehr als unteilbares Quantum, sondern es entspricht einem DNA-Segment, bestehend aus einer Sequenz von Basenpaaren, die einzeln mutieren und rekombinieren können.

Rekombination kann auch zwischen homologen Genen (bzw. homologen DNA-Sequenzen) erfolgen, die an verschiedenen Loci oder sogar auf verschiedenen Chromosomen liegen. Ungleiche Rekombination (unequal crossover) bei tandemrepetierten Genen wurde bereits beschrieben (Abb. 2.19).

Abb.2.22: Komplementationstest. Die rezessiven Mutationen (m1, m2, m3) in den Genen a, b und c werden heterozygot in der cis-Anordnung (auf dem gleichen Chromosom) und in trans-Stellung (auf verschiedenen Chromosomen) auf ihren Phänotyp getestet. Entsteht in der trans-Stellung der Wildphänotyp A, komplementieren die beiden Mutationen, betreffen also verschiedene Gene (Funktionseinheiten). Zeigen trans-heterozygote Tiere jedoch den Mutantenphänotyp B, komplementieren die beiden Mutanten nicht und betreffen somit das gleiche Gen.

In diesem Fall paaren die homologen (oder partiell homologen) Gene versetzt, so daß der Crossover-Vorgang durch Deletion bzw. Duplikation einer Genkopie führt. Es können aber auch DNA-Segmente zwischen partiell homologen Genen ausgetauscht werde, die auf verschiedenen Chromosomen liegen (intergenetische Konversion).

2.8.8 Ortsspezifische Rekombination und Transduktion

Bei Prokaryoten ist ortsspezifische Rekombination nachgewiesen worden. Der Lambda-Phage kann sich nach dem Eindringen in eine Bakterienzelle entweder vermehren und schließlich die Zelle auflösen oder seine DNA als sog. Provirus durch einen Crossover-Vorgang an einer bestimmten Stelle ins Bakterienchromosom einfügen. Die Homologie zwischen Bakterien- und Phagen-DNA am Integrationsort beschränkt sich auf 15 Basnepaare. Dieser Rekombinationsvorgang läßt sich in vitro rekonstruieren. In den meisten Fällen erfolgt das "Herausschneiden" des Phagens auf die Base genau. In seltenen Fällen wird jedoch ein Stück Wirts-DNA mit herausgeschnitten und in Phagenpartikel verpackt. Bei der nächsten Infektion können dann solche Partikel auch Wirtsgene von einem Bakterium auf ein anderes übertragen (Transduktion). Transduktion kommt auch bei höhere Organismen vor, bzw. bei der Übertragung von Oncogenen durch Retroviren.

2.8.7 Transposition

Es gibt neben der homologen und ortsspezifischen Rekombination auch eine "illegitime" Form der Rekombination, die zwischen nichthomologen DNA-Sequenzen erfolgt. Sie ist charakteristisch für transponierende genetische Elemente, die keinen festen Platz im Genom besitzen (hüpfende Gene).
Bei den einfachsten dieser Elemente, den Insertionssequenzen (IS), handelt es sich um definierte DNA-Segmente (einige 100 bp), die sich an neuen Chromosomenorten integrieren können. Diese Transposition erfolgt weitgehend unabhängig von der normalen homologen Rekombination und besteht in einer lokalen Replikation des IS-Elements, einem präzisen Herausschneiden des Elements an den Enden, dem Aufschneiden der Wirts-DNA und schließlich der Verknüpfung des replizierten Elements mit der Wirts-DNA an einem anderen Ort. Als Erkennungssignal für das Herausschneiden dienen kurze umgekehrt-repetitive Sequenzen an den Elementenden. An der Insertionsstelle entsteht je nach Element in der Zielsequenz eine kurze Duplikation (z.B. 5 b), deren Entstehung vermutlich darauf beruht, daß die Endonuclease die Wirts-DNA mit einem um 5 b versetzten Schnitt auftrennt. Nach dem Einsetzen des Elements werden dann beiderseits die fehlenden 5 b des entsprechenden DNA-Strangs repliziert. Die Anzahl der möglichen Integrationsorte ist i.d.R. sehr groß, obwohl eine gewisse Sequenzspezifität besteht. IS-Elemente kommen außer im Bakterienchromosom auch in Bakteriophagen und Plasmiden vor.
Transposomen tragen zusätzlich zu den Genen, die die Transposition steuern, noch weitere Gene. In der Regel bestehen sie aus zwei die betreffenden Gene flankierenden IS-Elementen. Diese können gleich oder umgekehrt orientiert sein. Transposonen sind von großer medizinischer Bedeutung, da sie Resistenzgene gegen Antibiotika übertragen können. Oft liegen mehrere Transposonen nebeneinander auf Resistenzfaktorplasmiden. Bakterien mit solchen R-Plasmiden sind gegen eine Anzahl verschiedener Antibiotika resistent und können ihre Plasmide von einer auf die andere Bakterienart übertragen.
Zu den komplexen transponierenden Elementen gehören bestimmte Bakteriophagen (z.B. Mu; kann an nahezu beliebigen Stellen ins Bakterienchromosom integrieren). Die transponierenden Elemente reichen also vom voll ausgebildeten Bakteriophagen (eindeutig ein intragenomischer Parasit) bis hin zu IS-Elementen (wenige 100 bp) als parasitische DNA. Fraglich ist, wie die Evolution hier abgelaufen ist.
Auch bei Eukaryoten sind zahlreiche transponierende Elemente gefunden worden (Box 2.1). Sie zeichnen sich durch terminal direkt oder umgekehrt repetierende Sequenzen aus.
Bei den Retroviren erfolgt die Transposition über eine RNA-Zwischenstufe. Das Genom der Retroviren besteht aus einsträngiger RNA, die bei der Replikation in doppelsträngige DNA umgeschrieben wird. Der Informationsfluß erfolgt also nicht wie üblich von der DNA zur RNA, sondern umgekehrt (Name!). Abb. 2.35 zeigt einen Replikationszyklus.

Abb. 2.35: Entwicklungszyklus eines Retrovirus. Das Virion enthält zwei identische RNA-Moleküle mit Kappe (K), terminal repetierter Sequenz (R), 5'-Terminus (U5), 3'-Terminus (U3), den drei Genen gag (gruppenspezifisches Antigen), pol (Reverstranskriptase) und env (Hüllprotein) und eine PolyA-Sequenz (An) am 3'-Ende. In der Nähe des 5'-Endes ist ein tRNA-Molekül der Wirtszelle gebunden, das als Primer für die Reverstranskription dient. Durch Reverstranskription der RNA entsteht doppelsträngige lineare DNA mit zwei long terminal repeats (LTR). Die lineare DNA wird zirkularisiert und integriert sich als Provirus ins Wirtsgenom (W). Das Provirus wird in genomische RNA transkribiert und zum Teil verspleißt. Die virale mRNA wird in virale Proteine übersetzt, die gespalten und glykosyliert (CHO) oder phosphoryliert (P) werden.

Wichtige Beispiele für Retroviren sind z.B. Influenza oder AIDS.

Ähnlich wie bei Retroviren erfolgt die Transposition von Ty-1- und copia- ähnlichen Elementen über eine RNA-Zwischenstufe, so daß man die Elemente als Retrotransposonen bezeichnet. Sie zeigen eine ähnliche Struktur wie Retroviren mit flankierenden LTR, die Promotoren und Polyadenylierungssignale enthalten. Zudem lassen sich Sequenzhomologien zu retroviraler Reverstranskriptase nachweisen. Außerdem findet man bei Drosophila-Zellkulturen Partikel, die Retroviruspartikel ähnlich sind und vollständige Copia-RNA enthalten. Für Ty-1 ist nachgewiesen, daß beim Transpositionsvorgang Introns herausgespleißt werden, was auf eine RNA-Zwischenstufe hindeutet. Insertion und Transposition darüber wird auch für eine zweite Klasse von Elementen angenommen, zu denen die F-Elemente von Drosophila sowie eine Klasse von Pseudogenen. Diese Elemente sind durch einen PolyA-Trakt am 3'-Ende des einen DNA-Strangs charakterisiert, dem ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) vorausgeht. Sie erzeugen Duplikationen von variabler Länge am Insertionsort und weisen keine LTR auf. Die Pseudogene sind eigentlich Kopien der entsprechenden mRNA und haben weder Introns noch einen eigenen Promotor. Auch die sog. Alu-Sequenzen beim Menschen entstehen wahrscheinlich durch Reverstranskription.

2.9 Transformation

Darunter versteht man die Übertragung genetischer Information auf einen Organismus durch isolierte DNA. Dies gelang zum ersten mal bei Pneumokokken. Bei Bakterien beruht der Transformationsvorgang auf der Aufnahme der Spender-DNA und deren ortsspezifischer Integration ins Chromosom, wobei mindestens partielle Sequenzhomologie zwischen Wirts- und Spender-DNA bestehen muß. Integriert wird nur ein Strang der Spender-DNA, obwohl doppelsträngige DNA aufgenommen wird. Dadurch entsteht ein Heteroduplex von bis zu mehreren kb Länge. Bei der nächsten Replikation trennen sich Spender- und Empfängerstränge voneinander und weden kopiert, so daß zwei Homoduplexe entstehen und eine der beiden Tochterzellen transformiert ist.
Auch bei der Hefe (Saccheromyces cervisiae) sind Methoden zur genetischen Transformation entwickelt worden. Als Vektor zur Übertragung der DNA kann man das sog. 2-Mikron-Plasmid verwenden, das als natürliches Plasmid bei vielen Hefestämmen in 50-100 Kopien pro Zelle vorkommt und autonom repliziert wird. Autonom replizierende Plasmide können auch aus bestimmten chromosomalen DNA-Sequenzen konstruiert werden (Autonom Replizierende Sequenzen, ARS).
Bei einzelligen Mikroorganismen lassen sich seltenen Transformanten aus Populationen mit 106-108 Zellen herausselektieren, bei höheren Metazoen ist das schwierig bis unmöglich; trotzdem sind für Drosophila und Maus Methoden der genetischen Transformation entwickelt worden, die es erlauben, Gene in die Keimbahn einzuführen. Dabei werden eine große Anzahl DNA-Moleküle direkt ins befruchtete Ei injiziert, was die Integrationswahrscheinlichkeit erhöht. Bei Drosophila wurde außerdem das P-Transposon als Vektor eingesetzt, der mit hoher Wahrscheinlichkeit ins Wirtsgenom eingebaut wird (vgl. Abb. 2.36).

Abb. 2.36: Gentransfer in die Keimbahn von Drosophila mit Hilfe des P-Transposons. P(w+)-Vektorplasmid mit white+-Passagieren, flankiert von den Enden des P-Transposons (PI). Ch = Wirtschromosom Fk = Furchungskerne G0 = Generation, die injiziert wird G1 = erste Nachkommengeneration P(w+) = rotäugige transformierte Fliege P = Parentalgeneration P' = Helferplasmid, das Transposase produziert PI' = defektes Ende des Helferplasmids w* = white-Fliege mit transformierter Keimbahn w(M) = white-M-Stamm (weißäugig)

Bei der Maus kommt es relativ häufig zu Integration und Ligation nichthomologer Sequenzen. Die bisher erfolgreichste Methode besteht darin, ca. 100-1000 Genkopien (lineare doppelsträngige DNA) in den männlichen Vorkern befruchteter Eier zu injizieren. Die sich entwickelnden Embryonen werden dann in eine Ammenmaus implantiert und können sich zu Mäusen entwickeln, die die injizierte DNA in ihre Chromosomen eingebaut haben (transgene Mäuse). Mit 25 % liegt die Transformationsfrequenz außerordentlich hoch. Im Gegensatz zur Transformierung von Drosophila mit P-Transposonen werden jedoch bei der Maus häufig mehrere Genkopien ins Genom eingebaut. Dabei scheinen die einzelnen Genkopien zu tandemrepetierten Komplexen (Concatemeren) verknüpft zu werden, die sich dann durch unspezifische (illegitime) Rekombination ins Chromosom integrieren. Dadurch resultiert eine stark schwankende Genexpression.
Auch Retroviren können als Vektoren dienen. Dabei macht man von ihrer Fähigkeit Gebrauch, Wirtszellen zu infizieren und als Provirus in die Wirtschromosomen zu integrieren. Das Spendergen wird in vitro in den Retrovirusvektor als "Passagier" eingesetzt. Anschließend werden junge Mausembryonen mit dem konstruierten Virus infiziert, so daß der Vektor mit den Passagieren in die Chromosomen der Keimbahnzellen integrieren kann. Aus diesen transformierten Keimbahnzellen können sich schließlich transgenische Mäuse entwickeln. Retroviren sind auch zur Gentherapie von somatischen Zellen verwendet werden.

2.10 In-vitro-Rekombination, Genklonierung und Gentechnik

Die Gentechnik beruht auf der Möglichkeit, DNA einerseits in vitro zu manipulieren und sie andererseits in vivo zu prüfen und zur Expression zu bringen. In der Gentechnik nimmt E. coli mit seinen Phagen und Plasmiden eine zentrale Stellung ein, da ein großer Teil des Instrumentariums von diesem Modellorganismus stammt und fremde DNA-Sequenzen in E. coli effizient vermehrt werden können. Dazu wurden erst Methoden der in-vitro-Rekombination entwickelt. Es ist dabei notwendig, DNA-Moleküle in definierte Fragmente zu spalten. Dazu werden Restriktionsenzyme verwendet, die zum Abwehrdispositiv von Bakterien gegen eindringende Fremd-DNA gehören: Endonucleasen, die bestimmte Basensequenzen erkennen und spalten. Durch eine nach der Spaltung eingesetzte Ligase können die Bruchstücke willkürlich wieder zusammengefügt werden (vgl. Abb. 2.37), was einer Rekombination in vitro entspricht.

Abb. 2.37: Spaltung (Restriktion) und Verknüpfung (Ligation) von DNA-Molekülen. Wenn Adenin methyliert ist (A*), kann die DNA nicht gespalten werden.

Mit dieser Methode können Hybridplasmide konstruiert werden. Die in vitro kostruierten Hybridplasmide lassen sich zur Genklonierung und damit zur Isolation bestimmter Gene verwenden. Das Vektorplasmid trägt außer einem Ursprung für die Replikation (ori) ein Resistenzgen, z.B. gegen Ampicillin (Amp^R in Abb. 2.38). Man transformiert deshalb einen ampicillinsensitiven Bakterienstamm mit dem Ligationsgemisch, das die Hybridplasmide enthält, und plattiert Bakterien auf einer Agarplatte mit Ampicillin aus (vgl. Abb. 2.39). Dabei überleben nur die Bakterien, die durch die Aufnahme eines Plasmids ampicillinresistent geworden sind. Da die Transformation ein seltenes Ereignis ist, wird pro Zelle höchstens ein Plasmid aufgenommen. Die transformierte Zelle teilt sich (Klon); man nennt das Verfahren daher auch Genklonierung.
Durch Isolation einer großen Anzahl von Klonen können Genbibliotheken aufgebaut werden, die das ganze Genom eines Organismus umfassen. Für den Menschen bedeutet das etwa eine Million Klone von durchschnittlich 15 kb Länge, während bei Drosophila nur ca. 50.000 Klone benötigt werden. Danach können die verschiedenen Gene identifiziert werden.
Zur charakterisierung des betreffenden DNA-Abschnittes erstellt man zunächst eine Restriktionskarte, die angibt, wo die Schnittstellen für bestimmte Restriktionsenzyme liegen. Durch RNA-Hybridisierung kann man feststellen, welche Abschnitte der DNA in RNA übersetzt werden und welcher der beiden DNA-Stränge abgelesen wird. Schließlich kann man die vollständige Basensequenz bestimmen, aus der sich i.a. auch die Sequenz der Aminosäuren im Polypeptid ableiten läßt.
Als Sonden zur Genklonierung können sowohl die RNA- als auch das Proteinprodukt verwendet werden. Bei geeigneten Organismen (z.B. Drosophila) stehen heute Methoden zur Verfügung, die es erlauben, jedes beliebige Gen zu isolieren, von dem einige geeignete Mutanten bekannt sind, ohne daß irgendwelche Kenntnisse über die biochemischen Eigenschaften der Genprodukte erforderlich wären.
Statt DNA kann auch mRNA kloniert werden, indem man mit Reverstranskriptase eine DNA-Kopie (cDNA) der RNA synthetisiert, diese in einen Vektor einsetzt und kloniert. Das Verfahren der Klonierung von cDNA erläutert Abb. 2.40.

Abb. 2.40: Synthese und Klonierung von cDNA.

Da due Struktur der mRNA nicht unbedingt der Struktur des Gens entspricht, sind cDNA-Klone nicht notwendigerweise mit chromosomalen Klonen identisch. Durch cDNA-Klonierung können auch mRNA-Moleküle isoliert werden, die nur in geringer Kopienzahl in der Zelle vorliegen. Aus ihrer DNA-Squenz läßt sich aufgrund des genetischen Codes die Aminosäuresequenz des codierten Proteins ableiten.

Die Gentechnik geht aber weit über rein analytische Verfahren hinaus: das isolierte Gen kann in vitro gezielt verändert (mutiert) werden. In vivo induzierte Mutationen sind Zufallsereignisse, die der Genetiker nicht steuern kann, sondern unter vielen Individuen selektieren muß; in vitro können Mutationen jedoch gezielt eingeführt werden. Die Transformationsverfahren erlauben es dann, die konstruierten Mutanten in vivo zu prüfen.
Klonierte Gene können auch mit Hilfe sog. Expressionsvektoren, z.B. in E. coli oder Hefezellen, exprimiert und die Genprodukte in größerer Menge isoliert werden (z.B. Produktion von Humaninsulin).
Auch die Totalsynthese von Genen ist heute möglich.

2.11 Genstruktur und Organisation des Genoms

Die Größe des Genoms eines Organismus läßt sich aus dem DNA-Gehalt einer haploiden Zelle, z.B. eines Spermiums, mit chemischen Methoden oder durch Absorptionsmessungen im UV cytophotometrisch bestimmen. Dabei zeigt sich, daß die Masse der DNA bzw. die Anzahl der Basenpaare (b) pro haploidem Genom innerhalb einer Spezies konstant ist, bei verschiedenen Organismen aber außerordentlich variiert (Tab. 2.2):

Im Allgemeinen nimmt die Größe des Genoms von Viren über Bakterien zu Eukaryoten zu. Die größten Genome findet man bei Amphibien, Lurchen und Lungenfischen sowie bestimmten Pflanzenarten. Es gibt aber keine Korellation zwischen Genomgröße und Organisationshöhe! Auch kann man die Genomgröße nicht auf Polyploidie zurückführen, wie sie bei vielen Pflanzen vorkommt. Die Genomgröße scheint der Anzhal der Gene nicht direkt proportional zu sein. Wozu dient dann die zusätzliche DNA bei Organismen mit großen Genomen?
Reassoziationsexperimente zeigen, daß die Genome von Viren und Bakterien mit der für einmalig vorkommende DNA-Sequenzen charakteristischen Kinetik zu doppelsträngigen DNA-Molekülen reassoziieren. Genome höherer Organismen sind dagegen wesentlich komplexer und enthalten außer den nur einmal vorliegenden auch repeptitive Sequenzen und hochrepetitive Sequenzen. Die Methode der Genisolation erlauben es, die Struktur der Gene im Genom direkt zu untersuchen.

Einmalige Gene: Die Struktur eines relativ einfachen eukaryotischen Gens ist in Abb. 2.41 schematisch skizziert (Hitzeschockprotein hsp22 aus Drosphila). Das synthetisierte Protein besteht aus 174 Aminosäuren. In diesem einfachen Fall enstpricht die DNA-Sequenz der mRNA- und Proteinsequenz, d.h. DNA und Protein sind colinear.
Bei höheren Organismen sind jedoch die meisten Gene in mehrere Abschnitte aufgespalten, also nicht colinear. Sie enthalten Introns, eingeschobene Sequenzen, die die RNA-codierenden Regionen (Exons) unterbrechen.

Abb. 2.41: Genstruktur. Struktur des Hitzeschockgens (hsp22). HSE = Hitzeschockelement TATAAA = TATA-Box AAUAAA = Polyadenylierungssignal 7 mG = Kappe der mRNA +1 = Start der Transkription AUG = Initiator-Methionin-Codon UAG = Stopcodon D = Polyadenylierungsstelle

In Abb. 2.42 ist z.B. das b-Globin-Gen der Maus dargestellt. Es ist von zwei Introns unterbrochen, die im Codon 31 und zwischen den Codons 104 und 105 eingeschoben sind. Das primäre Transkript umfaßt sowohl die drei Exons als auch die beiden Introns und enthält dazu zwei Schutzgruppen (die 7-Methylguanosin-triphosphat-Kappe am 5'-Ende und die PolyA-Sequenz am 3'-Ende). Anschließend werden die Introns als schleifenförmige DNA-Moleküle (Lariate) herausgeschnitten und die Exons mtieinander verknüpft (Vorspleißen). An den Exon/Intron-Grenzen findet man bestimmte Consensussequenzen. Da die beiden endständigen Basen des Introns 5' GT ... AG 3' weitgehend konstant sind, spricht man auch von der GT-AG-Regel. Das Verspleißen muß auf die Base genau erfolgen, da sonst das Leseraster verschoben wird. Beim Spleißvorgang sind bestimmte Ribonucleotidpartikel (RNP, Spliceosomen) beteiligt.
Bei vielen Genen unterteilen die Introns das entsprechende Protein in funktionelle Domänen, die dann im Verlauf der Evolution zu neuen Genen bzw. Proteinen zusammengefügt werden können (z.B. beim Hämoglobinmolekül).
Die b-Globin-Genfamilie des Menschen liegt auf dem Chromosom 11 und umfaßt außer den adulten Genen b und d zwei fötale Gene ^Gg und ^Ag sowie das embryonale Gen e. Auch hier findet man in den Bereichen zwischen den Genen ein Pseudogen (yb) und repetitive Elemente. Alle Gene sind auf dem gleichen Strang in der Reihenfolge angeordnet, in der sie während der Entwicklung exprimiert werden. Die Introns liegen im Vergleich zu den a-Genen an homologen Stellen. Bei den Globingenen des Huhns ist diese Anordnung jedoch verändert; die Gene liegen hier auf verschiendenen DNA-Strängen.

Repetierte Gene: Außer den einmaligen Genen gibt es zwei Arten von repetierten Genen, die mehrfach im Genom auftreten: tandemrepetierte Gene und dispersrepetierte Gene. Die bekanntesten Beispele unter den tandemrepetierten Genen sind die ribosomalen 18s- und 28s-Gene. Sie sind meist in einigen hundert Kopien im sog. Nucleolusorganisator lokalisiert, einem mit etwa 500 solcher Transkriptionseinheiten, die zunächst in ein Vorläufermolekül transkribiert werden, das dann durch Endonucleasen in mehreren Schritten in je ein Molekül 18s, 28s und 5,8s gespalten wird (Abb. 2.43B).

Abb. 2.43: Organisation des Genoms. A: Die Globingenfamilie des Menschen. Funktionelle Gene sind als farbige Rechtecke, Pseudogene als graue Rechtecke gezeichnet. Die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung an. Die schwarzen Dreiecke bezeichnen Alu-Sequenzen (mobile repititive Elemente) B: Tandemrepetierte Gene. Oben: Ribosomale RNA-Gene von Xenopus laevis. Die ca. 500mal repetierten Transkriptionseinheiten bestehen aus einem externen (ETS) und internen transkribierten Spacer (ITS) sowie je einem Segment, das für 18s-, 5.8s- und 28s rRNA codiert. Zwischen den Transkriptionseinheiten liegen nichttranskribierte Spacer (NTS). Siehe auch Abb. 2.9. Unten: Histongene des Seeigels Psammechinus miliaris. Eine Histonuntereinheit besteht aus je einem Gen für Histon H1, H4, H2B, H3 und H2A. Diese Gengruppen sind etwa 400mal tandemrepetiert.

Die reifen rRNA-Moleküle werden in die Ribosomen eingebaut, die transkribierten Teile des Spacers hydrolisiert. Zwischen den Transkriptionseinheiten gibt es nichttranskribierte Spacers, die in ihrer Länge variieren. Sie enthalten starke Promotoren für RNA-Polymerase I. Auch die ribosomale 5s-Gene sind tandemrepetiert, liegen jedoch nicht im Nucleolus. Bei Xenopus sind sie an den Enden der meisten Chromosomen in der Nähe der Telomere lokalisiert; bei Drosophila liegen die etwa 160 5s-Gene vereinigt in einem Abschnitt des 2. Chromosoms.
Unter den proteincodierenden Genen sind die Histongene tandemrepetiert.
Im Gegensatz zu den Genen, die für rRNA und Histone codieren, sind tRNA-Gene und z.B. Actin- und Tubulingene disrepetiert. In diesem Fall liegen einzelne Genkopien verstreut oder in kleinen Gruppen im Genom und sind z.T. auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert. Die genannten Gene besetzen innerhalb des Genoms feste Plätze.
Im Gegensatz dazu nehmen Transposonen, die ebenfalls dispers repetiert sind, keine festen Plätze im Genom ein. Ähnlich disrepetitive Elemente wie bei Drosophila findet man beim Menschen, z.B. die Alu-Sequenzen, die nach dem Restriktionsenzym Alu bezeichnet werden, mit dem sie als charakteristisches Fragment aus der DNA herausgeschnitte werden können. Das menschliche Genom enthält nicht weniger als 300.000 Alu-Sequenzen. Jedes einzelne Element ist etwa 300 b lang, so daß die Alu-Sequenzen insgesamt etwa 3 % des menschlichen Genoms ausmachen. Sie kommen auch im Spacer zwischen den Globingenen vor (Abb. 2.43A). Verschiedene strukturelle Eigeschaften der Alu-Sequenzen deuten darauf hin, daß es sich um mobile genetische Elemente handelt.
Hochrepetitive DNA-Sequenzen: Bei Eukaryoten findet man auch hochrepetitive DNA-Sequenzen, die zunächst als Satelliten-DNA beschrieben wurden. Fraktioniert man DNA von höheren Organsimen durch Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten, der die Moleküle nach ihrer Dichte auftrennt, bilden sich häufig neben dem Hauptbestand mit einer Dichte von 1,700 g ml-1 drei DNA-Satelliten, die insgesamt 41 % des Genoms darstellen (Tab. 2.3).

Die drei DNA-Satelliten sind A-T-reich und haben deshalb eine geringere Dichte. Sie bestehen aus einem Heptanucleotid, das millionenfach repetiert ist. Die Sequenz der Satelliten II und III läßt sich durch eine einzige Basensubstitution aus derjenigen des Satelliten I ableiten. Diese Sequenzen sind in Metaphasechromosomen hauptsächlich in der Nähe der Centromere im Heterochromatin lokalisiert, wo sie große Blöcke von tandemrepetierten Sequenzen bilden. Bei der nahe verwandten Drosophila americana findet man nur dan Satelliten I, während II und III fehlen. Weiter verwandten Arten fehlt auch der Satellit I. Über die Funktion dieser hochrepetitiven Sequenzen ist wenige bekannt. Sie scheinen nicht transkribiert zu werden und eine strukturelle Komponente des Chromosoms darzustellen. Satelliten-DNA gibt es bei den meisten Eukaryoten und auch beim Menschen, wo sie etwa 13 % des Genoms ausmacht.
Andere strukturelle DNA-Sequenzen liegen im Centromer und in den Telomeren. Im Centromer dient das DNA-Molekül als Bindungsstelle für das Kinetochor.
Auch der Telomer-DNA kommt eine wichtige Funktion zu, da freie DNA-Enden anscheinend instabil sind.
Außer den codierenden Sequenzen – den eigentlichen Genen – gibt es also noch weitere Komponenten im Genom: Hierzu zählen strukturelle Komponenten des Telomers und des Centromers, zu denen möglicherweise auch die Satelliten-DNA-Moleküle gehören. Ein überraschend hoher Anteil des Genoms besteht aus Transposomen, virusähnlichen Elementen und parasitischer DNA. In den Spacer-Sequenzen zwischen den Genen liegen Kontrollsequenzen für die Genregulation und außer Pseudogenen, die sich als stammesgeschichtliche Relikte interpretieren lassen, auch viele unbekannte Sequenzen, die zukünftiger Forschung vorbehalten bleiben.

2.12 Regelung der Genaktivität

Die meisten Zellen eines Organismus enthalten ein vollständiges Genom. Bestimmte Gene (z.B. Hämoglobine) werden nur in bestimmten Zelltypen benötigt, während Gene, deren Produkte in allen Zelltypen nötig sind (z.B. Enzyme des Stoffwechsels) in allen Zellen aktiv sind. Die Genexpression unterliegt einer exakten räumlichen und zeitlichen Kontrolle. Bestimmte Gene können durch Umweltfaktoren oder Hormone an- und abgeschaltet werden, andere sind dagegen stets aktiv (konstitutive Genexpression). Genaktivität kann in allen Synthesestufen bis hin zum Protein reguliert werden; primäre Genregulation erfolgt jedoch auf dem Niveau der Transkription.

2.12.1 Dosiskompensation und Inaktivierung des X-Chromosoms

Die Genaktivität läßt sich indirekt aus der Menge der gebildeten Genprodukte messen (Dosisproportionalität). Das gilt als Regel für autosomale Gene. Besondere Verhältnisse findet man bei den Geschlechtschromosomen: Das heterogametische Geschlecht besitzt von zahlreichen X-chromosomalen Loci nur eine Genkopie, während das homogametische Geschlecht über je zwei Kopien verfügt. Die Unterschiede in der Gendosis werden je nach Art verschieden kompensiert. Bei Säugern kommt es im weiblichen Geschlecht während der weiblichen Embryonalentwicklung zu einer mosaikartigen, zufälligen Abschaltung je eines X-Chromosoms. Das inaktive X-Chromosom ist als kondensierter Chromatinkörper (Barr-Körperchen) während der Interphase im Zellkern zu erkennen. Triplo-X-Individuen bilden zwei Barr-Körper, besitzen also auch nur ein aktives X-Chromosom. Damit wird die Menge des gebildeten Genproduktes ausgeglichen und die Genbalance aufrechterhalten. Im Barr-Körperchen ist die DNA stark methyliert und an bestimmte Proteine gebunden. Diese Proteine halten das Chromosom in einem stark kondensierten Zustand, in dem es für die Transkriptionsmaschinerie nicht zugänglich ist. Der inaktive Zustand wird bei der Zellteilung auf die Tochterchromosomen übertragen, so daß Klone entstehen, die entweder das väterliche oder das mütterliche Gen exprimieren. Das inaktive X-Chromosom bezeichnet man als heterochromatisch, da es mit bestimmten Farbstoffen weit stärker als das aktive euchromatische X-Chromosom angefärbt wird. Inaktive Chromosomen oder Chromosomenabschnitte sind meist kondensiert und heterochromatisch, während aktive Chromosomensegmente eine aufgelockerte Struktur aufweisen und sich nur schwach anfärben. Heterochromatin unterscheidet sich von Euchromatin auch in Bezug auf den Zeitpunkt der DNA-Replikation: Heterochromatin wird in der Regel später in der S-Phase repliziert als Euchromatin. Genaktivität, Chromatinstruktur und DNA-Replikation stehen also in engem Zusammenhang.

2.12.2 Genamplifikation

In besonderen Fällen kann die Menge des gebildeten Genprodukts auf der Stufe der DNA über die Anzahl der Genkopien reguliert werden. Dabei wird die Anzahl der Genkopien in einem bestimten Zelltyp, in dem eine erhöhte Genaktivität erforderlich ist, durch zusätzliche Replikation eines Chromosomenabschnittes erhöht.

2.12.3 Genaktivierung durch Veränderung der Genstruktur

Die Aktivierung eines Gens kann auch auf Umlagerung von Genabschnitten innerhalb des Chromosoms beruhen. So sind die Immunglobuline in der für die Keimbahn typischen Anordnung (vgl. Abb. 4.25) inaktiv. In den Lymphocyten werden sie erst durch einen somatischen Rekombinationsprozeß aktiviert.

2.12.4 Regulation der Transkription

Die primäre Regulation der meisten Gene findet auf der Stufe der Transkription statt. Die Anzahl der synthetisierten RNA-Moleküle pro Zeiteinheit ist dabei ein direktes Maß für die primäre Genaktivität. Die grundlegenden Untersuchungen zur Genregulation wurden bei Prokaryoten am Lactose-Operon und am Lambda-Repressor durchgeführt.
Ein Operon ist eine Gruppe von Genen, die gemeinsam reguliert und in eine einzige mRNA transkribiert werden.
Die Induktion der Genaktivität beruht auf dem Wechselspiel zwischen Umweltfaktoren (Lactosen) und zellinternen Genregulationsmechanismen. An letzteren sind zwei Regulatorgenen beteiligt, die für den lac-Repressor und das Catabolit-Genaktivatorprotein (CAP) codieren. Die Regulation der Genaktivität beruht auf der Bindung dieser Proteine an spezifische DNA-Sequenzen im lac-Operon (in der Nähe des Promotors), wodurch die Initiation der Transkription verhindert wird.
Zur Erreichung der maximalen Genaktivität wird zusätzlich das CAP-Protein benötigt, das im Gegensatz zum lac-Repressor vor dem Promotor an die cap-DNA-Sequenz bindt und die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor fördert, so daß die Transkriptionsrate erhöht wird. Die Regulation durch CAP besteht also in einer Aktivierung, die jedoch nur dann erfolgt, wenn cyclisches AMP, dessen Konzentration den physiologischen Zustand der Zelle widerspiegelt, an das CAP-Protein gebunden ist.
Lac-Repressor und CAP sind DNA-Bindungsproteine, die nach einem ähnlichen Strukturprinzip gebaut sind.
Auch bei höheren Organismen gibt es Kontroll- oder Regulatorgene, deren Funktion darin besteht, bestimmte andere Gene zu regulieren. Ein teil dieser Kontrollgene codiert für Transkriptionsfaktoren, die die Transkription entweder stimulieren oder hemmen. Die Transkriptionsfaktoren binden in ihren Zielgenen an bestimmte DNA-Sequenzen (Kontrollelemente) und bilden Transkriptionskomplexe. Die Kontrollelemente liegen meist in der Nähe des Promotors, doch können sie auch weit außerhalb des Gens, in einem Intron oder in der codierenden Region des Zielgens, liegen. Einige dieser Kontrollelemente reagieren auf bestimmte Signale wie Hormone, Temperaturerhöhung, Schwermetalle, usw. Andere sind für die räumliche und zeitliche Regulation der Genexpression in der Entwicklung verantwortlich. Von besonderer Bedeutung sind die Enhancer (Verstärkerelemente), die die Transkriptionsrate auf das Hundertfache steigern können.
Unter den Signalsubstanzen zur Regulation der Genaktivität sind Hormone von besonderer Bedeutung (Abb. 5.2B). Abb. 2.46 zeigt schematisch die Vorgänge von der Ausschüttung des Hormons bis zur Veränderung der Genaktivität am Beispiel eines Steroidhormons.

Abb. 2.46: Regulation der Genaktivität durch Steroide.  Das Steroidhormon dringt durch die Plasmamembran (Pm) ins Cytoplasma (Cy) ein. ‚ Es bindet an den entsprechenden Rezeptor. ƒ Der Steroidrezeptorkomplex bindet an das hormonresponsive Element (HRE) der DNA. „ Mit zwei weiteren Transkriptionsfaktoren (TBF und TF), die an die TATA-Box bzw. die Regulationssequenz (URS) binden, und der RNA-Polymerase bildet er einen aktiven Transkriptionskomplex, der das hormoninduzierbare Gen aktiviert. Kh = Kernhülle Nu = Nucleus

Steroidrezeptoren sind Proteine, die besondere, fingerähnliche Strukturen ("zinkbindende Finger") aufweisen. Diese "Finger" scheinen die spezifische Bindung an bestimmte Basensequenzen in der DNA zu ermöglichen. (s. unten).
Die Genaktivität wird nicht nur durch innere, sondern auch durch äußere Faktoren reguliert. Ein gut untersuchtes Beispiel liefert die Genreaktion auf einen Hitzeschock. Die geschilderte Hitzeschockreaktion, die auch durch andere Streßfaktoren ausgelöst werden kann, findet man bei allen bisher untersuchten Tieren – selbst bei Warmblütern einschließlich dem Menschen. Die Promotorregionen der Hitzeschockgene enthalten Hitzschockelemente (HSE), an die ein Hitzeschock-Transkriptionsfaktor binden kann. Der aktivierte Transkriptionsfaktor vermag innerhalb von weniger als 2 min nach der Temperaturerhöhung die Hitzeschockgene anzuschalten. Ihre Aktivierung manifestiert sich in der Ausbildung von Puffs an den entsprechenden Loci. Einige Stunden nach Rückkehr zur normalen Temperatur klingt die Hitzeschockreaktion ab. Das Genaktivitätsmuster, das für die betreffende Zelle charakteristisch ist, wird wiederhergestellt. Über die Funktion der Hitzeschockreaktion ist noch wenig bekannt, doch scheint es sich um eine Abwehrreaktion gegen Streß zu handeln.
Die Regulation der ribosomalen 5s-RNA ist beim Krallenfrosch Xenopus besonders intensiv studiert worden.

2.12.5 Posttranskriptionelle Genregulation

Die Steuerung der Genaktivität ist nicht auf das Niveau der Transkription beschränkt. Auch die folgenden Stufen der Genexpression können qualitativ und quantitativ reguliert werden. Da viele Gene aus mehreren Exons bestehen, können vom gleichen Gen durch unterschiedliches Verspleißen verschiedene mRNA-Moleküle oder Proteine abgelesen werden, die verschiedene Kombinationen von Exons enthalten. Alternatives Verspleißen findet man bei vielen Genen, wie z.B. bei den Myosingenen oder den Genen, die die Geschlechtsbestimmung kontrollieren.
Außer der Menge der gebildeten mRNA ist auch ihre Halbwertszeit wichtig, da von kurzlebiger mRNA nur wenige Proteine übersetzt werden. Die Stabilität der mRNA wird primär durch ihre Struktur bestimmt. Kurzlebige Messenger besitzen in ihrem Nachspann RNA-Sequenzen, die zu rascherem Abbau führen.
Auch auf der Stufe der Translation kann die Genexpression reguliert werden. In vielen Tiergruppen wird stabile mRNA in Form von Ribonucleoproteinpartikeln im EI gepsiechert. Erst nach der Befruchtung wird diese mRNA freigesetzt, an Ribosomen gebunden und in Protein übersetzt. Bei der Trnaslation werden häufig inaktive Vorstufen synthetisiert (z.B. Proenzyme, Prohormone), die erst durch Proteolyse in aktive Enzyme bzw. Hormone umgesetzt werden müssen. Proteine können auch durch Modifikation (z.B. Phosphorylierung) aktiviert oder inaktiviert werden. Selbst auf der Stufe der niedermolekularen Genprodukte gibt es Rückkoppelungsmechanismen: Das Substrat eines Enzyms kann die Aktivität des Gens, das für das betreffende Enzym codiert, induzieren. Andererseits kann das entsprechende Produkt bei hoher Konzentratione die Aktivität des Enzyms hemmen. Die Expression der Gene kann also auf allen Stufen reguliert werden.

2.13 Vom Gen zum Phän

Ein genbedingtes Merkmal (Phän) hängt nicht nur von der direkten Wirkung eines einzelnen Gens ab, sondern auch von inneren und äußeren Bedingungen. Unter den inneren Bedingungen sind vor allem der physiologische Zustand des Organismus, das Geschlecht und die Wechselwirkungen mit anderen Genen von Bedeutung. Von den äußeren Bedingungen wären Umweltfaktoren wie Temperatur, Nährstoffe, Sauerstoff aber auch das soziale Umfeld zu nennen.

2.13.1 Penetranz und Expressivität

Die Häufigkeit, mit der sich eine bestimmte Mutation unter den Trägern manifestiert, ist die Penetranz (Manifestationshäufigkeit). Eine rezessive Letalmutation kann z.B. bei allen homozygoten Trägern zum Tod vor der Geschelchtsreife führen (Penetranz: 100 %). Es kann aber auch einzelne Überlebende ("Durchbrenner") unter den Homozygoten geben; bei einer Penetranz von 90-95 % spricht man von Semiletalität, bei einer Sterblichkeit von weniger als 50 % von subvitalen Mutationen.
Auch der Grad der Ausprägung einer Mutation (Expressivität; Manifestationsstärke) kann variieren.

2.13.2 Pleiotropie und Polygenie

Die meisten Gene bestimmen nicht nur ein einzelnes Merkmal, sondern eine Vielzahl von Phänen (Pleiotropie). Die pleiotrope Wirkung eines Gens kann darauf beruhen, daß das Gen für mehrere Primärprodukte codiert, die z.B. durch alternatives Verspleißen des Transkripts entstehen und verschiedene Funktionen ausüben. Ein Gen. das an der Synthese eines Coenzyms beteiligt ist, kann auch die Aktivität mehrere Enzyme beeinflussen, die dieses Coenzym benötigt – ein scheinbarer Widerspruch zur "One-gene-one-enzyme"-Hypothese ist. In den meisten Fällen beruht Pleiotropie jedoch auf Sekundäreffekten.
Andererseits kann ein Phän von vielen Genen bestimmt sein (Polygenie). Das gilt vor allem für komplexe Phäne (z.B. Körpergröße, gewisse psychische Merkmale), bei denen natürlich auch Umweltfaktoren modifizierend eingreifen.

2.13.3 Umweltfaktoren

Die in der DNA gespeicherte genetische Information bestimmt die Rahmenbedingungen, die sog. Raktionsnorm, die noch verschiedene Realisationsmöglichkeiten offenläßt. Der freie Spielraum, innerhalb dessen sich Umweltfaktoren auswirken können, läßt sich bei genetisch identischen Individuen ungefähr abschätzen.
In andern Fällen ist der Einfluß von Umweltfaktoren erstaunlich groß: Je nach Ernährung kann aus einem Bienenei eine Königin oder eine Arbeiterin entstehen. Temperatur und Tageslänge können das äußere Erscheinungsbild einer Art drastisch verändern, z.B. die Fellfarbe des Hermelins (Mustela erminea); oder das Landkärtchen (Arschnia levana), ein Schmetterling, dessen Frühjahrs- und Sommergeneration sich von der Färbung her so sehr unterscheiden, daß sie von Linné für zwei verschiedene Arten gehalten wurden.

2.13.4 Wechselwirkung zwischen Genen

Gene wirken nicht isoliert als einzelne Fakroren, sondern steuern Entwicklungsvorgänge und Stoffwechsel durch mannigfaltige Wechselwirkungen (z.B. Augenfarbe bei Drosophila).
Bestimmte Mutationen können auch die Wirkung anderer Mutationen, die an der gleichen Stoffwechselkette beteiligt sind, unterdrücken (Epistase).

2.13.5 Geschlechtsgekoppelte und geschlechtsbegrenzte Vererbung

Geschlechtsbegrenzte Mutationen wirken sich entweder nur im weiblichen oder nur im männlichen Geschlecht aus. Sie betreffen Gene, deren Expression direkt oder indirekt durch das Geschlecht beeinflußt wird. Die geschlechtsbegrenzte Vererbung muß klar von der geschlechtsgekoppelten Vererbung unterschieden werden. Der Begriff geschlechtsgekoppelt besagt nur, daß das betreffende Gen auf den Geschlechtschromosomen lokalisiert ist (z.B. bei der Rot-Grün-Blindheit beim Menschen).
Im Gegensatz dazu können geschlechtsbegrenzte Mutationen auf irgendeinem Chromosom liegen.

2.13.6 Maternale und paternale Effekte

Besondere Einflüsse des mütterlichen Genotyps auf den Phänotyp der Nachkommen werden als Maternaleffekte bezeichnet. Sie ergeben sich aus der Tatsache, daß Spermium und Ei zwar je ein haploides Genom zur Nachkommenschaft beisteuern, daß aber der größte Teil des Cytoplasmas vom Ei, also von der Mutter beigesteuert wird. Während der Oogenese ist das Ei diploid. Die Meiose wird erst in der reifen Oocyte abgeschlossen, wenn das Cytoplasma bereits aufgebaut ist. Für die weitere Entwicklung ist es daher wesentlich, ob ein mutantes Ei von einer heterozygoten oder eine homozygoten Mutter produziert wird; denn nur im ersten Fall trägt ein normales Wildtyp-Allel zur Oogenese bei.
Bei einem strikten Maternaleffekt ist nur der Genotyp der Mutter von Bedeutung. Solche Maternaleffektmutanten zeigen, daß auch der Aufbau des für die Entwicklung des Embryos bedeutungsvolle Eicytoplasmas durch Gene gesteuert wird. In gewissen Fällen vermag das vom Spermium beigesteuerte väterliche Wildtyp-Allel den maternalen Defekt teilweise zu korrigieren. Da die mütterlichen Genprodukte, die im Ei eingelagert sind, nicht replizieren können, sind Maternaleffekte in der Regel auf eine Generation beschränkt. Das unterscheidet sie von der rein mütterlichen Vererbung cytoplasmatischer Komponenten (z.B. Mitochondrien), die autonom replizieren können. Analoge Paternaleffekte wurden beim Nematoden Caenorrhabditis nachgewiesen, bei dem das Spermium außer dem Zellkern auch eine substantielle Menge von Cytoplasma zur Zygote beisteuert.

2.14 Cytoplasmatische Vererbung

Im Gegensatz zur Vererbung von Genen des Zellkerns erfolgt die cytoplasmatische Vererbung nicht nach den Mendelschen Regeln. Cytoplasmatische Vererbung oder extrachromosomale Vererbung wurde zuerst von Correns bei Pflanzen gefunden; doch dauerte es Jahrzehnte, bis das entsprechende Gen eindeutig den Chloroplasten zugeordnet und gezeigt werden konnte, daß diese Organellen ihr eigenes Genom in Form von DNA enthalten. Auch Mitochondrien besitzen ihr eigenes Genom.
Beim Menschen zeigen die Mitochondrien mütterliche Vererbung. Diese kann anhand der mitochondrialen DNA (mtDNA) gezeigt werden. Mütterliche Vererbung erstreckt sich über beliebig viele Generationen, da die genetische Information fortlaufend repliziert wird. Maternaleffekte dagegen sind auf eine oder zwei Nachkommensgenerationen beschränkt, weil der cytoplasmatische Faktor aufgebraucht wird.
Eine Vererbung erworbener Eigenschaften konnte bisher nicht nachgewiesen werden, doch gibt es gewisse Grenzfälle, in denen sich ein erworbenes Merkmal als sog. Dauermodifikation über zahlreiche Generationen erhalten kann.

2.15 Somatische Zellgenetik

Die Methoden der Genetik können nicht nur auf die Keimbahn, sondern auch auf somatische Zellen angewendet werde. Sie liefern dann wichtige Aufschlüsse über Wachstum und Differenzierung somatischer Zellen.

2.15.1 Somatische Mutationen

Eine wichtige Ursache für die Entstehung von Krebstumoren sind somatische Mutationen. Bei einer bestimmten Form von Leukämie findet man in den betroffenen weißen Blutzellen regelmäßig eine Translokation, das sog. Philadelphia-Chromosom. Die Translokation führt dazu, daß ein Oncogen aktiviert oder falsch reguliert wird. Seine Aktivierung kann in einer Zelle, in der es normalerweise inaktiviert ist, dazu führen, daß die Zelle unkontrolliert und kontinuierlich weiterwächst. Die Hyperaktivierung des Oncogens kann auch auf einer somatischen Punktmutation beruhen. Auch die Insertion eines Retrovirus in die Nähe des zellulären Oncogens kann zur Aktivierung des Oncogens führen, da Retroviren häufig Enhancer enthalten. Schließlich können Oncogene ins Genom eines Retrovirus eingebaut und zu übertragbaren viralen Oncogenen werden. Nach der Infektion einer anderen Klasse von Oncogenen führt Inaktivierung des Oncogens durch somatische Mutation zur Krebsentstehung. Allgemein gilt, daß die Tumorentstehung einen mehrstufigen Prozeß darstellt, an dem verschiedene Faktoren beteiligt sind.

2.15.2 Somatische Rekombination

Somatische Rekombinationsvorgänge laufen in den Lymphocyten bei der Bildung der Antikörper und der T-Zell-Rezeptoren ab und ermöglichen die Erzeugung einer großen Vielfalt verschiedener Rezeptoren für Antigene.
Mitotische und meiotische Rekombination beruhen auf verschiedenen Mechanismen. Das geht u.a. daraus hervor, daß meitotisches Crossover bei Drosophila nur im €, mitotische Rekombination aber in beiden Geschlechtern stattfindet. Die Frequenz der mitotischen Rekombination ist im centromernahen Heterochromatin am höchsten. Analog zur meiotischen Rekombination kann sie als Maß für den Abstand zweier Gene gelten. Wie die Kartierung verschiedener Markierungsgene zeigt, ist die Genreihenfolge z.B. in den Epidermiszellen die gleiche wie in der Keimbahn und in den Riesenchromosomen der Speicheldrüse. Daraus können wir schließen, daß in diesen somatischen Zellen keine größeren Umstrukturierungen des Genoms erfolgen.

2.15.3 Immunogenetik

Das Immunsystem bei Wirbeltieren beruht grundsätzlich auf einem Erkennungsmechanismus von "selbst" und "nicht selbst" und einer Abwehrreaktion gegen Substanzen und Organismen, die als fremd erkannt werden. Diese Erkennung beruht auf Rezeptoren, die auf entsprechende Signale (Antigene) reagieren. Alle körperfremden Stoffe können als Antigene wirken. Der Erkennungsmeachnismus beruht auf der Bindung der Antigenmoleküle an Rezeptoren (Antikörper). Dieser Bindung liegt die komplementäre Struktur von Antigen und Antikörper zugrunde, die wie Schöüssel und Schloß zueinander passen. Die Mannigfaltigkeit der Rezeptoren, die Millionen von Antigenen erkennen, ist genetisch bedingt. Sie beruht aber nur zum Teil auf der Variabilität der Gene in der Keimbahn. Das große Repertoire der Rezeptoren wird durch somatische Rekombination und Mutation in den Immunzellen (Lymphocyten, Abb. 4.25) erzeugt.

Abb. 4.25: Schema der Hämatopoiese (Bildung der verschiedenen Blutzellen). Die diefferentielle Zellteilung der Stammzellen (SZ) trennt die Zellinie der Lymphocyten (schwarze Zellkerne) von der aller übrigen Blutzellen (graue Zellkerne). Alle Differenzierungsschritte erfolgen unter dem Einfluß spezifischer Signalproteine (Hormone: Hämatopoietine) und Rückkoppelungseffekte (farbige Pfeile); z.B. wird die Bildung von Erythrocyten (EC) aus Erythroblasten (EB) durch Erythropoietin stimuliert, das sich in der Niere als Antwort auf niedrigen O2-Gehalt des Blutes bildet.
B-LC = B-Lymphocyt EB = Erythroblast EC = Erythrocyt GR = Granulocyten LVZ = lymphoide Vorläuferzelle MB = Myeloblast MC = Monocyt MK = Megakaryocyt	MP = Makrophage MVZ = myeloide Vorläuferzelle PZ = Plasmazelle Rk = Rückkoppelungseffekt Si = Signalprotein SZ = multipotente Stammzelle TC = Thrombocyten (Blutplättchen) T-LC = T-Lymphocyt VZ = Vorläuferzellen (z.B. EB, MB)

Zur Markierung körpereigener Zellen dienen hauptsächlich Proteine des Histonkompatibilitätskomplexes (MHC). Diese Proteine werden von einer großen Familie engegekoppelter Gene codiert, die bei allen Wirbeltieren vorkommen und in ihrer DNA-Sequenz individuell außerordentlich stark variieren. Beim MHC wird die Vielfalt bereits in der Keimbahn erzeugt. Von jedem dieser Gene gibt es zahlreiche Varianten (Allele), so daß kaum zwei Individuen der gleichen Art identisch sind. Nur eineiige Zwillinge oder Tiere, die zum gleichen Inzuchtstamm gehören, sind gleich. Die MHC-Gene codieren für Membranproteine, die auf der Oberfläche der meisten Zellen und Gewebe vorkommen und die Gewebeverträglichkeit (Histonkompatibilität) bei Gewebetransplantationen bestimmen. Gewebe eines fremden MHC-Genotyps werden vom Immunsystem als "nicht selbst" erkannt und abgestoßen, während Transplantate gleicher genetischer Konstitution mit dem Empfänger verträglich sind und verheilen können.
Zur Erkennung körperfremder Antigene erzeugen die Zellen des Immunsystems Rezeptoren, deren Vielfalt hauptsächlich auf somatischer Rekombination und Mutation beruht. Die Rezeptoren können in zwei Typen eingeteilt werden, die von verschiedenen Lymphocyten gebildet werden:

• Immunoglobuline (= Antikörper) werden von B-Lymphocyten gebildet und kommen entweder als membrangebundenes Protein an der Oberfläche von B-Lymphocyten vor oder werden ins Blutserum sezerniert.
  Die Vielfalt der variablen Regionen der Immunoglobuline kommt durch einen somatischen Rekombinationsmechanismus zustande, bei dem variable und konstante Genregionen, die in den Chromosomen der Keimzellen weit voneinander getrennt liegen, neu verknüpft werden.
• T-Zell-Rezeptoren werden von T-Lymphocyten sythetisiert.

Der Rekombinationsmechanismus für Immunoglobuline ist in Abb. 2.50 für die leichte Immunoglobulinkette (Kappa) der Maus schematisch dargestellt.

Abb. 2.50: Somatische Rekombination der Immunoglobulingene der Maus. Rekombination der variablen Region (V-J) bei der leichten Kette Kappa.  Genstruktur in der Keimbahn C = konstantes Exon Ck = konstante Region Jk, Vk = variable Regionen J1-4 = Verbindungsexons L1-n = Leader-Exons R, R' = Erkennungssequenzen für Rekombinationsenzyme ƒ enthält ein zusätzliches J-Segment, das beim Verspleißen der RNA „ entfernt wird. Die reife mRNA … wird in eine leichte Kappa-Kette † übersetzt.

Auch bei der schweren Kette kommt die Vielfalt durch somatische Rekombination zustande. Die Anzahl möglicher Aminosäuresequenzen wird zusätzlich durch somatische Mutationen erhöht. Die Gesamtzahl möglicher Antikörper liegt schätzungsweise bei ca. 10¹¹. In dieser Vielfalt liegt jedoch die Erklärung dafür, daß eine Maus Antikörper gegen Antigene produzieren kann, die es bisher in der Natur noch gar nicht gegeben hat und die erst heute von Chemikern synthetisiert werden.
Unter den Immunoglobinen (Ig) gibt es verschiedene Klassen, die nacheinander im Verlauf einer Immunreaktion auftreten (membrangebundenes IgM, sezernierte IgM, IgG, IgE, IgA). Alle diese Klassen unterscheiden sich bei identischer variabler Region in ihrer konstanten Region C. Die DNA-Segemente, die für die verschiedenen konstanten Regionen codieren, liegen nebeneinander auf dem Chromosom. Der Klassenwechsel (Switch) von einer Ig-Klasse zur nächsten beruht ebenfalls auf einem somatischen Rekombinationvorgang auf DNA-Niveau (vgl. Abb. 2.51 für IgM zu IgG).

Abb. 2.51: Somatische Rekombination der Immunoglobulingene und Immuniglobulin-Klassenwechsel bei der Maus (vereinfacht). c = Gene für die leichte Kette mit V-J-Rekombination H = Gene für die schwere Kette mit V-D-J-Rekombination Klassenwechsel durch Rekombination der konstanten Region von der µ- zur g3- und zur g1-Kette. D = Diversifizierungsregionen (diversity regions) J = Verbindungsregionen (joning regions) V = variable Region c =constante Region der leichten Kette m, d, g, a, e = konstante Regionen, die für die entsprechenden schweren Ketten der verschiedenen Immunoglobulinklassen codieren Die Pfeile deuten den Verlauf der Rekombinationsereignisse an.

Der Übergang von membrangebundenen zu löslichen Formen beruht jedoch nicht auf Rakombination, sondern erfolgt auf dem RNA-Niveau durch differentielle Polyadenylisierung und Verspleißung der RNA. Das transkript der membrangebundenen Form weist zwei zusätzliche Exons auf und codiert für ein längeres Protein als das Transkript der löslichen Form.
Der T-Zell-Rezeptor für Antigene weist zwar eine immunoglobulinähnliche Struktur auf, bleibt aber im Gegensatz zum B-Zell-Rezeptor stets membrangebunden. T-Zellen sind v.a. für die zellvermittelte Immunität verantwortlich, während B-Zellen durch die Sekretion der Antikörper ins Bluserum eine humorale Immunität aufbauen. Die somatische Rekombination ist hier unpräzise, weshalb eine zusätzliche Variabilität der Regionen, die das Antigen binden, eintritt und die Vielzahl der T-Zell-Rezeptoren derjenigen der Immunglobuline gleicht.
Die Klonale Selektionstheorie (Ehrlich, Jerne, Burnett) besagt, daß von den Stammzellen laufend neue B-Lymphocyten produziert werden, die auf ihrer Oberfläche Immunoglobuline tragen, die potentiell als Rezeptor für Antigene dienen können. Jede Zelle exprimiert nur einen bestimmten Rezeptor mit einer bestimmten Bindungsspezifität. Aus der großen Vielfalt der Rezeptoren binden zufällig nur einige wenige ein bestimmtes Antigen. Durch die Bindung des Antigens wird diejenige Zelle, die den entsprechenden Rezeptor trägt, aktiviert. Das hat zur Folge, daß sich die betreffende Zelle zu vermehren beginnt und eine Zellfamilie (Klon) bildet, deren Zellen alle den gleichen Rezeptor auf ihrer Oberfläche tragen. Das Antigen selektioniert also einen Klon von B-Lymphocyten, die eine Abwehrreaktion aufbauen können.
Bei den meisten Immunreaktionen werden gleichzeitig mehrere Klone aktiviert, so daß die meisten Antiseren polyklonal sind und daher verschiedene Immunoglobuline enthalten. Bei gewissen Formen von Krebs (Plasmocytome) vermehren sich einzelne B-Zellen-Klone kontinuierlich, so daß sie überhand nehmen. In Zellkultur produzieren sie monoklonale Antikörper mit nur einer Sorte Immunoglobuline. Diese können in vitro gezüchtet werden und haben in der modernen Biologie als spezifische Sonden eine enorme Bedeutung erlangt.

2.15.4 Fusion somatischer Zellen

Aus Primärkulturen, deren Zellen direkt aus dem Tier explantiert werden, können durch fortlaufendes Weiterzüchten und Klonierung permanente Zellinien etabliert werden, die kontinuierlich wachsen. Solche Zellen zeigen aber nicht mehr denselben Phänotyp wie die ursprünglichen Zellen, häufig findet man auch Chromosomenabberationen. Dennoch sind sie für somatische Zellgenetik geeignet. In solche Zellinien lassen sich Resistenzmutationen induzieren, die zur Selektion von Hybridzellen dienen können. Zur Fusion werden zwei Zellinien verwendet, die verschiedene, einander komplementierende Mutationen aufweisen. Nach entsprechender Behandlung und Fusion entsteht ein Heterokaryon (ein zwei- oder mehrkerniges Gebilde); in einem Teil davon verschmelzen bei der nächsten Mitose die Kerne und es entsteht eine Hybridzelle. Nach der Fusion werden durch geeignete Wahl des Nährmediums die Hybridzellen selektioniert. Hybridzellen z.B. zwischen Mensch und Maus erlauben es, durch entsprechende Selektionierung bestimmte menschliche Gene bestimmten Chromosomen zuzuordnen. So ist es gelungen, die menschliche Genkarte weiter zu vervollständigen.

2.15.5 Gentransfer in Zellkulturen

Somatische Zellen können durch die Zugabe reiner DNA genetisch transformiert werden. Die verschiedenen Gentransfermethoden eröffnen wie die Verwendung von Retrovirusvektoren bei schweren Erbkrankheiten die Möglichkeit einer Gentherapie an somatischen Zellen.